Un robusto flusso di lavoro di elaborazione crioelettronica a particella singola (cryo-EM) con crioSPARC, RELION e Scipion

I recenti progressi sia nella strumentazione che nel software di elaborazione delle immagini hanno reso la microscopia crioelettronica a singola particella (cryo-EM) il metodo preferito dai biologi strutturali per determinare strutture ad alta risoluzione di un'ampia varietà di macromolecole. Diverse suite software sono disponibili per utenti nuovi ed esperti per l'elaborazione delle immagini e il calcolo della struttura, che semplificano lo stesso flusso di lavoro di base: i filmati acquisiti dai rilevatori al microscopio vengono sottoposti a correzione per la stima del movimento indotto dal fascio e della funzione di trasferimento del contrasto (CTF). Successivamente, le immagini delle particelle vengono selezionate ed estratte dai fotogrammi di filmato medi per la classificazione iterativa 2D e 3D, seguita da ricostruzione, perfezionamento e convalida 3D. Poiché vari pacchetti software impiegano algoritmi diversi e richiedono diversi livelli di esperienza per funzionare, le mappe 3D che generano spesso differiscono per qualità e risoluzione. Pertanto, gli utenti trasferiscono regolarmente i dati tra una varietà di programmi per risultati ottimali. Questo documento fornisce una guida per gli utenti per navigare in un flusso di lavoro attraverso i pacchetti software più diffusi: cryoSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3 per ottenere una struttura di risoluzione quasi atomica del virus adeno-associato (AAV). Per prima cosa dettagliamo una pipeline di elaborazione delle immagini con cryoSPARC v3, poiché i suoi algoritmi efficienti e la GUI facile da usare consentono agli utenti di arrivare rapidamente a una mappa 3D. Nella fase successiva, utilizziamo PyEM e script interni per convertire e trasferire le coordinate delle particelle dalla migliore qualità di ricostruzione 3D ottenuta in cryoSPARC v3 a RELION-3 e Scipion 3 e ricalcolare le mappe 3D. Infine, delineiamo i passaggi per un ulteriore perfezionamento e convalida delle strutture risultanti integrando algoritmi di RELION-3 e Scipion 3. In questo articolo, descriviamo come utilizzare efficacemente tre piattaforme di elaborazione per creare un flusso di lavoro unico e robusto applicabile a una varietà di set di dati per la determinazione della struttura ad alta risoluzione.