En robust kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) prosesseringsarbeidsflyt med kryoSPARC, RELION og scipion

Nylige fremskritt innen både instrumenterings- og bildebehandlingsprogramvare har gjort enpartikkel cryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) til den foretrukne metoden for strukturbiologer for å bestemme høyoppløselige strukturer av et bredt utvalg av makromolekyler. Flere programvarepakker er tilgjengelige for nye og ekspertbrukere for bildebehandling og strukturberegning, noe som effektiviserer den samme grunnleggende arbeidsflyten: filmer anskaffet av mikroskopdetektorene gjennomgår korreksjon for stråleindusert bevegelses- og kontrastoverføringsfunksjon (CTF) estimering. Deretter velges og trekkes partikkelbilder ut fra gjennomsnittlige filmrammer for iterativ 2D- og 3D-klassifisering, etterfulgt av 3D-rekonstruksjon, presisering og validering. Fordi ulike programvarepakker bruker forskjellige algoritmer og krever forskjellige kompetansenivåer for å fungere, varierer 3D-kartene de genererer ofte i kvalitet og oppløsning. Dermed overfører brukere regelmessig data mellom en rekke programmer for optimale resultater. Dette dokumentet inneholder en veiledning for brukere om å navigere i en arbeidsflyt på tvers av de populære programvarepakkene: cryoSPARC v3, RELION-3 og Scipion 3 for å få en nesten atomisk oppløsningsstruktur for det adeno-tilknyttede viruset (AAV). Vi detaljerer først en bildebehandlingspipeline med cryoSPARC v3, da dens effektive algoritmer og brukervennlige GUI lar brukerne raskt komme til et 3D-kart. I neste trinn bruker vi PyEM og interne skript for å konvertere og overføre partikkelkoordinater fra 3D-rekonstruksjon av beste kvalitet oppnådd i kryoSPARC v3 til RELION-3 og Scipion 3 og omberegne 3D-kart. Til slutt skisserer vi trinn for videre forbedring og validering av de resulterende strukturene ved å integrere algoritmer fra RELION-3 og Scipion 3. I denne artikkelen beskriver vi hvordan du effektivt bruker tre behandlingsplattformer for å opprette en enkelt og robust arbeidsflyt som gjelder for en rekke datasett for høyoppløselig strukturbestemmelse.