Un robusto flujo de trabajo de procesamiento de criomicroscopía electrónica de una sola partícula (cryo-EM) con cryoSPARC, RELION y Scipion

Los avances recientes tanto en instrumentación como en software de procesamiento de imágenes han hecho que la microscopía crioelectrónica de una sola partícula (cryo-EM) sea el método preferido por los biólogos estructurales para determinar estructuras de alta resolución de una amplia variedad de macromoléculas. Múltiples suites de software están disponibles para usuarios nuevos y expertos para el procesamiento de imágenes y el cálculo de estructuras, que agilizan el mismo flujo de trabajo básico: las películas adquiridas por los detectores de microscopio se someten a corrección para la estimación de la función de transferencia de contraste y movimiento inducida por haz (CTF). A continuación, las imágenes de partículas se seleccionan y extraen de fotogramas de película promediados para la clasificación iterativa 2D y 3D, seguida de la reconstrucción, el refinamiento y la validación en 3D. Debido a que varios paquetes de software emplean diferentes algoritmos y requieren diferentes niveles de experiencia para operar, los mapas 3D que generan a menudo difieren en calidad y resolución. Por lo tanto, los usuarios transfieren datos regularmente entre una variedad de programas para obtener resultados óptimos. Este documento proporciona una guía para que los usuarios naveguen por un flujo de trabajo a través de los paquetes de software populares: cryoSPARC v3, RELION-3 y Scipion 3 para obtener una estructura de resolución casi atómica del virus adenoasociado (AAV). Primero detallamos una canalización de procesamiento de imágenes con cryoSPARC v3, ya que sus algoritmos eficientes y su GUI fácil de usar permiten a los usuarios llegar rápidamente a un mapa 3D. En el siguiente paso, utilizamos PyEM y scripts internos para convertir y transferir coordenadas de partículas de la reconstrucción 3D de mejor calidad obtenida en cryoSPARC v3 a RELION-3 y Scipion 3 y recalcular mapas 3D. Finalmente, describimos los pasos para un mayor refinamiento y validación de las estructuras resultantes mediante la integración de algoritmos de RELION-3 y Scipion 3. En este artículo, describimos cómo utilizar eficazmente tres plataformas de procesamiento para crear un flujo de trabajo único y robusto aplicable a una variedad de conjuntos de datos para la determinación de estructuras de alta resolución.