Ett robust arbetsflöde för bearbetning av kryo-elektronmikroskopi med en partikel (kryo-EM) med kryoSPARC, RELION och Scipion

Nya framsteg inom både instrumentering och bildbehandlingsprogramvara har gjort kryoelektronmikroskopi med en partikel (kryo-EM) till den föredragna metoden för strukturbiologer att bestämma högupplösta strukturer av en mängd olika makromolekyler. Flera programvarusviter är tillgängliga för nya och expertanvändare för bildbehandling och strukturberäkning, vilket effektiviserar samma grundläggande arbetsflöde: filmer som förvärvas av mikroskopdetektorerna genomgår korrigering för uppskattning av strålinducerad rörelse och kontrastöverföringsfunktion (CTF). Därefter väljs partikelbilder och extraheras från genomsnittliga filmramar för iterativ 2D- och 3D-klassificering, följt av 3D-rekonstruktion, förfining och validering. Eftersom olika mjukvarupaket använder olika algoritmer och kräver olika kompetensnivåer för att fungera, skiljer sig de 3D-kartor de genererar ofta i kvalitet och upplösning. Således överför användare regelbundet data mellan en mängd olika program för optimala resultat. Detta dokument ger en guide för användare att navigera i ett arbetsflöde över de populära mjukvarupaketen: cryoSPARC v3, RELION-3 och Scipion 3 för att få en nära atomupplösningsstruktur för det adenoassocierade viruset (AAV). Vi beskriver först en bildbehandlingspipeline med cryoSPARC v3, eftersom dess effektiva algoritmer och lättanvända GUI gör det möjligt för användare att snabbt komma fram till en 3D-karta. I nästa steg använder vi PyEM och interna skript för att konvertera och överföra partikelkoordinater från 3D-rekonstruktion av bästa kvalitet som erhållits i cryoSPARC v3 till RELION-3 och Scipion 3 och beräkna om 3D-kartor. Slutligen beskriver vi steg för ytterligare förfining och validering av de resulterande strukturerna genom att integrera algoritmer från RELION-3 och Scipion 3. I den här artikeln beskriver vi hur du effektivt använder tre bearbetningsplattformar för att skapa ett enda och robust arbetsflöde som är tillämpligt på en mängd olika datauppsättningar för högupplöst strukturbestämning.