Diese Forschung wurde durch einen CAREER-Preis der National Science Foundation an SH unter der Preisnummer 2047572 unterstützt. Wir danken Damien Rivera für seine Unterstützung bei der Aufzucht von Fruchtfliegen und der Vorbereitung auf den topischen Anwendungsassay, Dr. Ganetzky von der University of Wisconsin-Madison für die gemeinsame Nutzung seiner Canton-S-Fruchtfliegensorte, den Centers for Disease Control and Prevention für die gemeinsame Nutzung des Rockefeller-Stammes und dem United States Department of Agriculture Center for Medical Agricultural and Veterinary Entomology für die gemeinsame Nutzung des IICC-Isoline-Stammes. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt.

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Moskitos sind jedes Jahr für über 700.000 Todesfälle aufgrund der Krankheiten verantwortlich, die sie auf den Menschen übertragen, wobei mehr als die Hälfte dieser Todesfälle allein auf Malaria zurückzuführenist 1. Die wichtigste vorbeugende Methode gegen die Übertragung von Malaria und anderen vektorübertragenen Krankheiten ist die Verwendung von Insektiziden, oft in Form von lang anhaltenden Insektizidnetzen oder Indoor-Restsprühen2. Die Insektizidresistenz ist jedoch bei Moskitos und anderen Insektenvektoren sowie bei landwirtschaftlichen Schädlingenweit verbreitet 3,4. Um den Widerstand effektiv zu bewältigen, ist die Überwachung von zentraler Bedeutung5. Dazu werden hochgenaue und hochdurchlässige Widerstandsdetektionsmethoden benötigt. Derzeit sind die am weitesten verbreiteten Überwachungsinstrumente für Insektizidresistenzen für Moskitos der WHO-Röhrentest 6 und der CDC-Flaschenbioassay7. Für Fruchtfliegen ist die Restkontakt-Applikationsmethode (ähnlich dem CDC-Flaschen-Bioassay) ein häufig verwendeter Insektizid-Bioassay 8,9,10. Die Variabilität der Daten aus diesen Methoden ist jedoch typischerweise hoch, wobei die Messungen desselben Labormückenstamms von ~ 20-70% Mortalität in CDC-Flaschentests und 0-50% in WHO-Röhrchentests reichen, wenn sie subletalen Dosierungen ausgesetzt sind11. Eine solche Variation ist überraschend, da die begrenzte genetische Variation in den meisten Laborstämmen voraussichtlich zu einer begrenzten Variation der Insektizidanfälligkeit in der Population führen wird. Dennoch gibt es immer noch ein hohes Maß an Variation, das in den Bioassay-Ergebnissen beobachtet wird.
Mögliche Quellen dieser Variation könnten das Ergebnis einer heterogenen Insektizidexposition zwischen Proben innerhalb des Bioassays sein, die auf eine indirekte Insektizidexposition über die Oberfläche, heterogene Umweltauswirkungen, normale biologische Variationen zwischen Individuen desselben Genotyps und Variationen in der Masse von Proben derselben Population zurückzuführenist 12 . Eine selten verwendete Methode mit höherer Replizierbarkeit ist der topische Applikationsbioassay. In diesem Assay wird das Insektizid direkt auf jedes Insekt13,14 aufgetragen, wodurch der Faktor der heterogenen Exposition verschiedener Proben innerhalb desselben Assays entfernt wird. Aufgrund des langsamen Durchsatzes dieser Methode wird sie jedoch nicht routinemäßig als Insektizid-Suszeptibilitätsüberwachungsinstrument für Mückenpopulationen verwendet. Dieses Papier stellt ein modifiziertes Protokoll für den topischen Anwendungsbioassay vor, das eine höhere Durchsatzexposition ermöglicht und gleichzeitig die Variation der Insektenmasse korrigiert, ein Parameter, der mit Änderungen der Insektizidempfindlichkeit korreliert12. Eine Verringerung des Lärms und der massenbedingten Variation der Mortalitätsdaten aufgrund der variablen Insektizidexposition würde eine genauere Überwachung der technischen Resistenzen ermöglichen11,15. Solche Daten könnten verwendet werden, um phänotypische Resistenzen genauer mit genetischen Markern, Fitnessparametern und/oder Vektorkompetenz in Verbindung zu bringen. Darüber hinaus zeigen wir, wie dieser Assay leicht an andere Insektenarten angepasst werden kann, indem der topische Anwendungsbioassay an Fruchtfliegen, einer kleineren Insektenart, verwendet wird.
Die Haupteinschränkung der oben genannten Restkontaktanwendungen besteht darin, dass die Insektizidexposition von Probe zu Probe innerhalb desselben Assays variieren kann. Im Falle von CDC-Flaschenbioassays und der Kontaktmethode kann die Insektizidexposition zwischen Replikaten desselben Assays variieren. Die Insekten sind einem Insektizid ausgesetzt, das entweder auf der Innenseite einer Glasflasche (CDC-Flaschenbioassay und Kontaktmethode) oder auf imprägnierten Papieren (WHO-Röhrchentest) verteilt ist. Die Konzentration von Insektiziden auf beiden Oberflächen (Glas und Papier) ist bekannt und durch das Screening verschiedener Arten bekannter Genotypen vorbestimmt. Die Menge, die zur potenziellen Aufnahme durch das Insekt zur Verfügung steht, kann jedoch stark variieren, abhängig von der verwendeten Oberfläche, den Insektizidmischungskomponenten und der Homogenität des Insektizids über das Oberflächenmaterial16,17. Beim CDC-Flaschenbioassay hängt die Insektizidbeschichtung auf der Innenseite der Flasche von den Verfahren ab, die von jedem Labor und Benutzer angewendet werden. Beim WHO-Tubentest werden die mit Insektiziden behandelten Papiere zentral produziert und sind damit höchstwahrscheinlich in den Labors recht homogen. Beim WHO-Tubentest ermöglicht das Belichtungsröhrchen den Proben jedoch, auf einem nicht mit Insektiziden belichteten Metallgewebe zu landen und sich dort auszuruhen, was zu einer potenziellen heterogenen Insektizidexposition unter den Proben innerhalb jedes Tests führt. Die tatsächliche Menge an Insektizid, die von Proben über jede Methode aufgenommen und absorbiert wird, muss noch weiter erforscht werden18.
Darüber hinaus werden der CDC-Flaschenbioassay, der WHO-Röhrchentest und die Kontaktmethode am häufigsten als Schwellenassays verwendet, um nur eine vorbestimmte Insektizidkonzentration zu testen. Dieser Ansatz kann das Vorhandensein von Resistenzen genau erkennen und ist wertvoll für die Widerstandsüberwachung (insbesondere wenn sich der Widerstand ausbreitet). Schwellenwert-Assays können jedoch die Stärke der Resistenz nicht quantifizieren, was die Wirksamkeit von Interventionsinstrumenten besser vorhersagen könnte. Wenn mit diesen Methoden mehrere Insektizidkonzentrationen verwendet werden, können sie als Intensitätstests verwendet werden. Intensitätstests für den CDC-Flaschenbioassay und den WHO-Röhrchentest wurden eingeführt, indem 5x und 10x der vorgegebenen diskriminierenden Dosierungen getestet wurden, um diese Lücke in der Überwachung zu schließen 6,19. 3-5 (vorbestimmte) Dosierungen bieten zwar eine bessere Möglichkeit, zwischen resistenten Populationen zu unterscheiden, bieten jedoch eine begrenzte Auflösung zur Berechnung tödlicher Konzentrationen. Darüber hinaus werden Moskitos verschiedener Größen in solchen verwendetSays. Es ist jedoch wichtig, die Masse zu messen, da größere Proben möglicherweise eine höhere Dosis benötigen, um getötet zu werden, da die effektive Dosis pro Masseneinheit viel niedriger ist als die eines kleineren Organismus12. Die Berechnung einer massenrelativierten tödlichen Dosis (Menge an Insektizid pro Insektenmasse) wäre eine nützlichere Metrik als die häufigere tödliche Konzentration (z. B. Menge an Insektizid pro Oberfläche), da sie die Variation der Insektenmasse zwischen Geschlechtern, Populationen und Genotypen berücksichtigt. Solche Daten würden dazu beitragen, die Lücke zwischen genotypischer und phänotypischer Resistenz innerhalb des Labors und des Feldes zu schließen, und könnten auch eine einfache Möglichkeit bieten, die erforderliche Anwendungskonzentration zur Behandlung einer Population von Insekten mit einer bekannten durchschnittlichen Masse zu berechnen.
Die Verwendung von massenrelativierten tödlichen Dosierungen, die 50% der Proben töten (LD50), beinhaltet auch mehrere andere Vorteile. Die Beurteilung der Toxizität einer bestimmten Verbindung in mg/kg (= ng/mg) ist Standard in der Human- und Veterinärtoxikologie14, und LD50-Werte sind auf Sicherheitsdatenblättern zu finden. Tödliche Dosierungen ermöglichen auch einen direkten Vergleich der Toxizität zwischen verschiedenen Chemikalien für eine bestimmte Spezies oder derselben Chemikalie gegenüber verschiedenen Spezies20 sowie eine qualitativ hochwertige Bewertung neuartiger Insektizide und Chemikalien13. Darüber hinaus kann die LD50 aussagekräftigere und genauere Resistenzverhältnisse liefern als diejenigen, die aus diagnostischen Dosismortalitätsergebnissen abgeleitet werden, was zu einer Überschätzung des in einer Population vorhandenen Resistenzniveaus führen kann. Daher wäre dieser Assay für routinemäßige Überwachungsprogramme geeignet, da er eine strengere Resistenzüberwachung auf der Grundlage von massenrelativierten tödlichen Dosen bietet, die von mehr Proben stammen, als für andere Bioassaysempfohlen werden 21.
Die topische Applikationsmethode wurde in der Insektizid-Suszeptibilitätsüberwachung für Moskitos und Fliegen als Alternative für die Standard-Insektizid-Suszeptibilitäts-Bioassays verwendet, wenn die Resistenz bereits bekannt ist oder vermutetwird 22,23, sowie für die Überwachung bei einigen Schädlingsinsekten24 zur genaueren Beurteilung von Resistenzprofilen und intrinsischer Toxizität von Insektiziden 21 . Bei Bioassays zur topischen Anwendung wird das Insektizid auf jeden Organismus aufgetragen, was zu einer minimalen Variation der Insektizidexposition führt. Dieses Papier stellt eine leicht angepasste und verbesserte Methode vor, die es ermöglicht, in kurzer Zeit eine Insektizidexposition auf eine große Anzahl von Insekten anzuwenden und gleichzeitig die Insektenmasse zu kontrollieren22. Diese Methode mit höherem Durchsatz und guter Replizierbarkeit könnte ein nützliches zusätzliches Werkzeug für die routinemäßige Überwachung der Insektizidanfälligkeit sein.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>20A00L068</td>
			<td>Acetone aliquot storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL screw cap tubes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1182K23</td>
			<td>Insecticide dilution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>339651</td>
			<td>Insecticide dilution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0334125D</td>
			<td>Fruit fly weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 &#956;L syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14815288</td>
			<td>Topical applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423240040</td>
			<td>ACS 99.6%, 4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti (IICC strain)</td>
			<td>USDA CMAVE</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide resistant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti (Rockefeller strain)</td>
			<td>CDC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide susceptible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-557-409</td>
			<td>Precision up to 0.1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>6.49986E+11</td>
			<td>Mosquito collection device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89126-794</td>
			<td>Place under workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B092S8JVQN</td>
			<td>Use for sorting insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool balls</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B0769MKZWT</td>
			<td>Use for sucrose solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispenser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1482225</td>
			<td>Repeater pipettor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster (Canton-S strain)</td>
			<td>University of Wisconsin-Madison</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide susceptible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped paint brushes</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07KT2X1BK</td>
			<td>Use for sorting insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fruit fly stock bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS355</td>
			<td>Use for rearing and sorting fruit flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-held CO2 dispenser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1710679</td>
			<td>Use for knocking down insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding cups</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08DXG7V1S</td>
			<td>Clear plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice pack</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08QDWMMW5</td>
			<td>Use for knocking down fruit flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice trays</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>9301085269</td>
			<td>Use for knocking down insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect forceps</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07B4767WR</td>
			<td>Insect forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insecticide</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc</td>
			<td>45423-250MG</td>
			<td>Deltamethrin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling stickers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07Q4X9GWX</td>
			<td>3/4&#34; Color dot stickers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00X6A1GYK</td>
			<td>White tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netting</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07F2PHHWV</td>
			<td>Use for covering holding cups and insect handling tent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712H371</td>
			<td>100 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC Pipe</td>
			<td>Lowe&#8217;s</td>
			<td>23971</td>
			<td>Insect handling tent materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00006IBRU</td>
			<td>Use for securing mesh/net on cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01J78INO0</td>
			<td>Granulated White Sugar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12578-165</td>
			<td>4&#34; x 4&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

topical application bioassay to quantify insecticide toxicity for mosquitoes and fruit flies

Der fortgesetzte Einsatz von Insektiziden für die öffentliche Gesundheit und die Landwirtschaft hat zu einer weit verbreiteten Insektizidresistenz und Behinderung der Bekämpfungsmethoden geführt. Die Überwachung der Insektizidresistenz von Mückenpopulationen erfolgt in der Regel durch Flaschenbioassays der Centers for Disease Control and Prevention (CDC) oder Tubentests der Weltgesundheitsorganisation (WHO). Diese Methoden können jedoch zu einer hohen Variabilität der Mortalitätsdaten führen, da der Kontakt mit dem Insekt variabel ist, die relativ geringe Anzahl der getesteten Organismen, die große Variation der Masse zwischen den Populationen und die sich ständig ändernden Umweltbedingungen, die zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. In diesem Artikel wird der topische Anwendungsbioassay vorgestellt, der als phänotypischer Hochdurchsatz-Bioassay für Moskitos und Fruchtfliegen geeignet ist, um eine große Anzahl von Insekten entlang einer Reihe von Insektizidkonzentrationen zu testen.
Dieser Assay 1) gewährleistet eine konsistente Behandlung und den Kontakt mit Insektiziden mit jedem Organismus, 2) erzeugt hochspezifische Dosis-Wirkungs-Kurven, die Unterschiede in der Durchschnittsmasse zwischen Stämmen und Geschlechtern berücksichtigen (was besonders für im Feld gesammelte Organismen wichtig ist), und 3) ermöglicht die Berechnung statistisch strenger mittlerer tödlicher Dosen (LD50 ), die für Vergleiche des Resistenzverhältnisses notwendig sind - ein alternativer Überwachungsansatz aus der diagnostischen Dosismortalität, der auch für die Überwachung der Larvizidresistenz verwendet wird. Dieser Assay wird ein ergänzendes Werkzeug für die genaue Phänotypisierung von Mückenpopulationen sein und, wie mit Fruchtfliegen veranschaulicht, leicht für die Verwendung mit anderen Insekten angepasst werden können. Wir argumentieren, dass dieser Assay dazu beitragen wird, die Lücke zwischen genotypischer und phänotypischer Insektizidresistenz bei mehreren Insektenarten zu schließen.

Diese repräsentativen Ergebnisse zeigen zwei verschiedene Stämme von Ae. aegypti, Rockefeller (ROCK) und einen isolierten Feldstamm aus Florida mit bekannten Knockdown-Widerstandsmutationen F1534C und V1016I (IICC-Genotyp). Zusätzlich wird Drosophila melanogaster (Kanton: S-Stamm) vorgestellt.
Abbildung 2 und Abbildung 3 veranschaulichen die Dosis-Wirkungs-Beziehung jedes Organismus nach Stamm und Geschlecht, die nach dem obigen Protokoll getestet wurden. Da keine Unterschiede zwischen den Dosis-Wirkungs-Kurven von männlichen und weiblichen Moskitos innerhalb jedes Stammes beobachtet wurden (t = 1,70, p = 0,098 für ROCK und t = 0,64, p = 0,527 für IICC), wurden Daten beider Geschlechter innerhalb jedes Mückenstamms gepoolt. Die massenrelativierten LD 50 für ROCK und IICCbetragen 0,008 ng/mg (95% CI: 0-0,104) bzw. 0,336 ng/mg (95% CI: 0,235-0,438). Die 95%-CIs dieser Werte überschneiden sich nicht, was auf signifikant unterschiedliche Dosis-Wirkungsweisen der Stämme hinweist. Die RR der IICC-Sorte (relativ zur ROCK-Sorte) beträgt 41,7, was laut WHO als hochbeständiggilt 5. Für die Canton-S-Fruchtfliegen beträgt die massenrelativierte LD50 0,213 ng/mg (95% KI: 0-0,490).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig02.jpg"> Abbildung 2: Repräsentative Daten von Mücken mittels topischer Anwendung Bioassay. Repräsentative Dosis-Wirkungs-Daten aus dem Bioassay zur topischen Anwendung nach dem obigen Protokoll unter Verwendung von Deltamethrin und Moskitos: (A) weibliche Ae. aegypti ROCK (n = 880) und IICC (n = 550) Stämme, (B) männliche Ae. aegypti ROCK (n = 880) und IICC (n = 569) Stämme. Deltamethrin-Testkonzentrationen reichten von 0,00075 ng / μL bis 9,68705 ng / μL, und die Dosis von Deltamethrin, die pro durchschnittlicher Mückenmasse (mg) angewendet wird, spiegelt sich auf der x-Achse wider. Die Mortalität wird als Anteil auf der y-Achse dargestellt. Die schwarze Linie durch jeden Datenpunktcluster stellt die dehnungs- und geschlechtsspezifische lineare Regression dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig03.jpg"> Abbildung 3: Repräsentative Daten von Fruchtfliegen mittels topischem Applikationsbioassay. Repräsentative Dosis-Wirkungs-Daten aus dem Bioassay zur topischen Anwendung nach dem obigen Protokoll unter Verwendung von Deltamethrin und Fruchtfliegen: D. melanogaster Canton-S-Stamm (n = 1014). Die Deltamethrin-Testkonzentrationen lagen zwischen 0,00499 und 5,02876 ng / μL, und die Dosis von Deltamethrin, die pro durchschnittlicher Fruchtfliegenmasse (mg) angewendet wird, spiegelt sich auf der x-Achse wider. Die Mortalität wird als Anteil auf der y-Achse dargestellt. Die schwarze Linie stellt die lineare Regression dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Zusatzfigur S1: Tisch-Insekten-Handling-Zelt. Benchtop-Insekten-Handling-Zelt wird verwendet, um entkommene Moskitos oder Fliegen während des topischen Applikationstests leichter zu fangen. Die Struktur ist in A geschlossen und in B offen. Diese Struktur wurde mit PVC-Rohr und feinmaschigem Gewebe gebaut. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure1.Final.V1.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung S2: Spritzen- und Repeater-Applikatoreinheit. Spritzen- und Repeater-Applikatoreinheit zur Dosierung von Insekten. Hauptteile sind 1) Nadel, 2) Spritzenlauf, 3) Kolben, 4) Repeater und 5) Repeater-Taste. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure2.Final.V1.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 1: Randomisierungsskript: Randomisierungsskript, um unvoreingenommene Etiketten für alle Tassen jedes Experiments zu erstellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File1_Randomization.Script.Final.V1.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 2: Mortalitäts-Score-Blatt: Mortalitäts-Score-Sheet zur Unterstützung der Mortalitätsbewertung. Das Blatt enthält auch Orte zum Aufzeichnen aller anderen wichtigen Informationen, auf die im Protokoll verwiesen wird, z. B. die Start- und Endzeiten der Insektizidanwendung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File2_Mortality.Score.Sheet.Final.V1%20(1).docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Supplemental File 3: Beispiel-Mortalitätsdaten: Beispieldatendatei, die zum Erstellen von Abbildung 2 verwendet wird. Die Beschreibungen der Spaltenüberschriften lauten wie folgt: "id" = Identifikationscode jedes Datenpunkts; "Art" = Artname (z. B. Aedes aegypti); "Insektizid" = Name des topisch applizierten Insektizids (z. B. Deltamethrin); "Stamm" = Name des Mückenstamms (z. B. ROCK); "Datum" = Startdatum thematische Anwendung; "Sex" = Geschlecht von Moskitos; "Alter" = Alter der Mücken (jung = 3-5 Tage alt; alt = 4 Wochen alt); "total.mosq" = Gesamtzahl der Moskitos, die in der Charge gewogen werden; "Gewicht" = Gewicht (mg) aller Moskitos innerhalb der Charge; "Konzentration" = Konzentration des Insektizids (μg/ml); "Spritze" = Tröpfchenvolumen (ml) der Spritze; "Dosis" = Menge des Insektizid-Wirkstoffs, der auf jede Mücke (ng) aufgetragen wird; "gesamt" = Anzahl der Moskitos in jeder Tasse; "tot" = Anzahl der toten Moskitos in jeder Tasse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File3_Example.Data.Final.V1%20(1).txt" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 4: R-Analysecode: Beispiel R-Code, der zum Abschließen der Probit-Analyse verwendet werden kann (wie in Schritt 8 des Protokolls beschrieben). Die repräsentativen Ergebnisse (zugänglich über die ergänzende Beispieldatendatei) können mit diesem R-Code verwendet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File4.Final.V3%20(1).R" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies at JoVE.com

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

Wir beschreiben die Methodik und Bedeutung des topischen Anwendungsbioassays zur Messung der Insektizidempfindlichkeit bei Moskitos und Fruchtfliegen. Der vorgestellte Assay ist ein hoher Durchsatz, verwendet Insektenmasse - so dass eine massenrelativierte tödliche Dosis anstelle der Konzentration berechnet werden kann - und hat wahrscheinlich eine geringere Variabilität als andere ähnliche Methoden.

Topische Anwendung Bioassay zur Quantifizierung der Insektizidtoxizität für Moskitos und Fruchtfliegen

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

Durch die direkte Anwendung von Insektiziden auf das Insekt und nicht durch Oberflächenkontakt gibt es nur minimale Unterschiede in der Insektizidbelastung, und dies ermöglicht es uns, das Anfälligkeitsprofil von Mückenpopulationen genauer zu messen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir massenrelativierte tödliche Dosen eines Insektizids anstelle von tödlichen Konzentrationen berechnen können, was die Vergleiche der Resistenzverhältnisse erheblich verbessert. Achten Sie darauf, die Insektizide ordnungsgemäß zu lagern, vermeiden Sie es, Ihre Werkzeuge zu kontaminieren, und stellen Sie sicher, dass die Spritzenteile in gutem Zustand sind.Dies wird Ihnen helfen, konsistente Ergebnisse zu erzielen. Entfernen Sie zunächst die benötigten Insektizidlösungen aus dem Gefrierschrank. Wirbeln Sie die Lösung sofort um oder invertieren Sie sie fünfmal und legen Sie sie in einen lichtbeständigen Behälter bei Raumtemperatur, um die Insektizide vor der Verwendung auf Raumtemperatur erwärmen zu lassen.Stellen Sie fünf Mikrozentrifugenröhrchen mit jeweils 0,5 Millilitern Aceton auf. Füllen Sie den Spritzenzylinder vollständig mit Aceton aus dem ersten Röhrchen. Dann das Aceton in einen Abfallbehälter ausstoßen, indem Sie schnell auf den Kolben drücken, und wiederholen Sie vier weitere Male, um insgesamt fünf Acetonwäschen aus demselben Acetonaliquot durchzuführen.Füllen Sie dann den Spritzenlauf vollständig mit Luft und leiten Sie die Luft und mögliche Acetonreste in den Abfallbehälter aus. Wiederholen Sie dies noch zwei weitere Male, um drei Wäschen mit Luft durchzuführen. Erstellen Sie eine Lufttasche innerhalb des Zylinders zwischen dem Spritzenkolben und der Oberseite der Nadel, indem Sie den Kolben etwa fünf Millimeter in den Lauf ziehen.Beschriften Sie die Plastikbecher mit der zufälligen ID für die Blindensterblichkeitsbewertung. Mit einem Aspirator, der durch Absaugen aus dem Einatmen angetrieben wird, aspirieren Sie die gewünschte Anzahl von drei bis fünf Tage alten erwachsenen Moskitos. Legen Sie die Spitze des Aspirators in das Rohr mit Baumwolle, die um die Spitze gewickelt ist.Atme vorsichtig aus und tippe auf den Aspirator, um die Moskitos in eine konische Röhre zu bringen. Verwenden Sie die Baumwolle, um das Rohr zu verstopfen, wenn die Aspiratorspitze entfernt wird, und schließen Sie es dann mit dem Deckel ab. Schlagen Sie die Moskitos kurz in den Röhren nieder, indem Sie sie für mindestens 10 Minuten bei vier Grad Celsius platzieren oder unter dem Eis in einer Eisschale vergraben.Bringen Sie die niedergeschlagenen Moskitos in das Insektenhandhabungszelt. Kippen Sie die Moskitos vorsichtig auf ein Plastiktablett, das auf dem Eis platziert ist, und gießen Sie etwa 50 Moskitos gleichzeitig, um sicherzustellen, dass jede das kühle Tablett darunter berührt und niedergeschlagen bleibt. Sortieren Sie die Moskitos nach Geschlecht, indem Sie sie vorsichtig an den Beinen oder Flügeln mit einer Pinzette aufheben, gefolgt von jedem Geschlecht in eine separate Haltetasse legen und aufhören, wenn die gewünschte Anzahl erreicht ist.Entfernen Sie beim Sortieren alle Moskitos, die verletzt sind oder besonders groß oder klein sind. Um das Gewicht des Mückenbechers aufzuzeichnen, legen Sie eine leere Tasse mit einer Petrischale als Deckel auf die Waage und tieren Sie die Waage. Gießen Sie die Moskitos in den Behälter und legen Sie den Deckel darauf.Legen Sie den Behälter auf die Waage und notieren Sie das Endgewicht zusammen mit der Anzahl der Moskitos. Stellen Sie die Tasse der Proben sofort wieder auf das Eis, um sie immobilisiert zu halten, bis alle Becher des Exemplars gewogen sind. Teilen Sie die vorbereiteten Moskitos in fünf bis 10 separate Tassen, die auf Eis gelegt und mit zufälligen IDs beschriftet sind.Verwenden Sie eine Pinzette und eine Handtheke, um 20 bis 25 Moskitos pro Tasse zu erreichen. Um die Fruchtfliegen zu sortieren, betäuben Sie die Fliegen sieben Sekunden lang mit Kohlendioxid. Gießen Sie die Fliegen auf einen Eisbeutel, der in Bankpapier eingewickelt ist.Trennen und zählen Sie mit einem Pinsel mit feiner Spitze die Männchen und Weibchen. Verwenden Sie den Pinsel, um die ausgewählten Fliegen vorsichtig aufzunehmen und in eine saubere, leere Lagerflasche zu legen. Nachdem Sie die gleiche Anzahl männlicher und weiblicher Fruchtfliegen ausgewählt haben, beschriften Sie die Lagerflaschen mit dem Stammnamen und der Fruchtfliegensumme.Anästhesieren Sie die Flasche Fruchtfliegen sieben Sekunden lang mit Kohlendioxid. Gießen Sie die Fruchtfliegen auf das Wiegepapier und verwenden Sie das Papier als Trichter, um die Fliegen in ein geteertes Fläschchen einzuführen, das mit einer zufälligen ID beschriftet ist.Nachdem Sie den Deckel der Petrischale auf die Durchstechflasche mit Fruchtfliegen gelegt haben, legen Sie sie auf die Waage. Notieren Sie das kombinierte Gewicht und die Anzahl der Proben auf dem Scoresheet.Legen Sie sofort das Fläschchen mit Fruchtfliegen in ein Eistablett mit dem Deckel noch oben, um zu verhindern, dass die Fliegen entkommen. Laden Sie die Spritze mit der richtigen Insektizidkonzentration, beginnend mit der am wenigsten konzentrierten Dosis, und arbeiten Sie mit jeder Organismengruppe auf die konzentrierteste Dosis hin. Kippen Sie die Proben auf Wiegepapier, das auf einem Tablett auf dem Eis platziert ist.Trennen Sie die Proben, die nahe beieinander liegen, mit einem sauberen, insektizidfreien Pinsel oder Wattestäbchen, um einen einfachen Zugang zu jeder Probe zur Dosierung zu ermöglichen. Tragen Sie mit der Spritze einen Tropfen Insektizidlösung auf den ventralen Thorax- und Bauchbereich für Moskitos und den Dorsum für Fruchtfliegen auf. Gießen Sie die Proben sofort wieder in den beschrifteten Plastikbecher.Decken Sie die Tasse mit einem Netz und einem Gummiband ab. Beachten Sie eine aktualisierte Probenzählung auf dem Becher, wenn Exemplare dabei getötet, beschädigt oder entkommen sind. Legen Sie den fertigen Becher in ein Haltefach.Notieren Sie für die erste Tasse den Zeitpunkt, zu dem die Dosierung abgeschlossen ist. Wiederholen Sie die Dosierung für jede Tasse, bis alle Proben mit den richtigen Insektizidkonzentrationen dosiert wurden, und notieren Sie die Endzeit, wenn alle Proben dosiert wurden. Geben Sie 10% Saccharoselösung zu jeder Tasse über einen nassen Wattebausch und lagern Sie die Moskitos und Fruchtfliegen bei der gewünschten Temperatur und Luftfeuchtigkeit.Erfassen Sie die Probensterblichkeit 24 Stunden nach Beginn der Insektizidexposition. Klassifizieren Sie Moskitos als lebendig, wenn sie fliegen können und halten Sie sich aufrecht und tot, wenn sie unbeweglich oder ataxisch sind, wie von der WHO beschrieben. Befolgen Sie die gleiche Mortalitätsbewertung für Fruchtfliegen.Nach der Durchführung des Bioassays wurden Dosis-Wirkungs-Daten mit zwei Stämmen erhalten, die Rockefeller- und IICC-Genotyp für den männlichen und weiblichen Aedes aegypti sind. Die massenrelativierte mittlere letale Dosis für Rockefeller und IICC betrug 0,008 bzw. 0,336 Nanogramm pro Milligramm. Die Ergebnisse zeigten keine Unterschiede zwischen den Dosis-Wirkungs-Kurven von weiblichen und männlichen Moskitos innerhalb jedes Stammes.Daher wurden Daten beider Geschlechter kombiniert, um die medianen letalen Dosiswerte zu berechnen. Da sich die 95%-Konfidenzintervalle für die mediane letale Dosis dieser beiden Stämme nicht überschnitten, wurden diese Werte als signifikant unterschiedlich angesehen. Darüber hinaus war die IICC-Sorte bei der Berechnung der Widerstandsverhältnisse über 40-mal widerstandsfähiger als die anfällige Rockefeller-Sorte.Dosis-Wirkungs-Daten für Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, Canton-S-Stamm, wurden ebenfalls erhalten, und die massenrelativierte mediane letale Dosis wurde mit 0,213 Nanogramm pro Milligramm festgestellt. Konsistenz ist entscheidend, insbesondere bei der Lagerung und Anwendung des Insektizids und der Beurteilung der Mortalität. Achten Sie auch beim Umgang mit der Probe darauf, Schäden oder Tod zu vermeiden, die nicht durch das Insektizid verursacht werden.Mit dieser Methode können wir nun die technische Resistenz einer Mückenpopulation genau bestimmen und wie sich die Umweltbedingungen auf die Resistenz auswirken oder wie die technische Resistenz die praktische Resistenz vorhersagt.