מחקר זה נתמך על ידי פרס CAREER על ידי הקרן הלאומית למדע ל- SH תחת מספר הפרס 2047572. אנו מודים לדמיאן ריברה על עזרתו בגידול זבוב הפירות והכנתו לבדיקת יישומים מקומיים, לד"ר גנסקי מאוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון על שיתוף זן זבוב הפירות שלו Canton-S, למרכזים לבקרת מחלות ומניעתן על שיתוף זן הרוקפלר, ולמרכז לאנטומולוגיה חקלאית ווטרינרית של משרד החקלאות של ארצות הברית על שיתוף זן האיזולין IICC. איור 1 נוצר עם BioRender.com.

המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.

יתושים אחראים ליותר מ-700,000 מקרי מוות מדי שנה כתוצאה מהמחלות שהם מעבירים לבני אדם, כאשר יותר ממחצית ממקרי המוות הללו נובעים ממלריה בלבד1. שיטת המניעה העיקרית נגד העברת מלריה ומחלות אחרות המועברות על ידי וקטורים היא השימוש בקוטלי חרקים, לעתים קרובות בצורה של רשתות קוטל חרקים ארוכות טווח או ריסוס שיוריפנימי 2. עם זאת, עמידות לקוטלי חרקים נפוצה בקרב יתושים וווקטורים אחרים של חרקים, כמו גם מזיקים חקלאיים 3,4. כדי לנהל ביעילות את ההתנגדות, המעקב הוא בעל חשיבות מרכזית5. לשם כך, יש צורך בשיטות זיהוי עמידות מדויקות מאוד ובתפוקה גבוהה. נכון לעכשיו, כלי המעקב הנפוצים ביותר אחר עמידות לקוטלי חרקים עבור יתושים הם בדיקת הצינור של ארגון הבריאות העולמי6 ובקבוק ה- CDC bioassay7. עבור זבובי פירות שיטת יישום המגע השיורי (בדומה לבדיקה הביולוגית של בקבוק ה-CDC) היא בדיקה ביולוגית נפוצה של קוטל חרקים 8,9,10. עם זאת, השונות בנתונים משיטות אלה היא בדרך כלל גבוהה, כאשר המדידות של אותו זן יתושים במעבדה נעות בין כ-20-70% תמותה בבדיקות בקבוקים של CDC ו-0-50% בבדיקות הצינור של ארגון הבריאות העולמי כאשר הן נחשפות למינונים תת-קרקעיים11. שונות כזו מפתיעה משום שהשונות הגנטית המוגבלת ברוב זני המעבדה צפויה להוביל לשינויים מוגבלים ברגישות לקוטלי חרקים באוכלוסייה. עם זאת, עדיין יש רמה גבוהה של שונות שנצפתה בתוצאות הבדיקה הביולוגית.
מקורות פוטנציאליים לשונות זו יכולים להיות תוצאה של חשיפה לקוטלי חרקים הטרוגניים בין דגימות בתוך הבדיקה הביולוגית עקב חשיפה עקיפה של קוטל חרקים דרך פני השטח, השפעות סביבתיות הטרוגניות, שונות ביולוגית נורמלית בין פרטים מאותו גנוטיפ, ושונות במסת הדגימות של אותה אוכלוסייה12 . שיטה שנעשה בה שימוש לעתים רחוקות עם שכפול גבוה יותר היא הבדיקה הביולוגית של היישום המקומי. במבחן זה, קוטל החרקים מוחל ישירות על כל חרק13,14, ומסיר את גורם החשיפה ההטרוגנית של דגימות שונות בתוך אותה בדיקה. עם זאת, בשל אופי התפוקה האיטית של שיטה זו, היא אינה משמשת באופן שגרתי ככלי מעקב אחר רגישות לקוטלי חרקים עבור אוכלוסיות יתושים. מאמר זה מציג פרוטוקול שונה עבור היישום האקטואלי bioassay המאפשר חשיפות לתפוקה גבוהה יותר תוך תיקון לשונות במסת החרקים, פרמטר המתאם לשינויים ברגישות לקוטלי חרקים12. הפחתה ברעש ושונות הקשורה להמוניה בנתוני התמותה מחשיפה משתנה לקוטלי חרקים תאפשר מעקב עמידות טכני מדויק יותר11,15. נתונים כאלה יכולים לשמש כדי לקשר בצורה מדויקת יותר עמידות פנוטיפית עם סמנים גנטיים, פרמטרים של כושר ו/או יכולת וקטורית. בנוסף, אנו מדגימים כיצד ניתן היה להתאים את הבדיקה הזו בקלות למיני חרקים אחרים על ידי שימוש ביישום היישום המקומי bioassay על זבובי פירות, מין חרקים בעל גוף קטן יותר.
המגבלה העיקרית של יישומי המגע השיוריים הנ"ל היא שהחשיפה לקוטלי חרקים עשויה להשתנות מדגימה לדגימה בתוך אותו מבחן. במקרה של בדיקות ביולוגיות של בקבוק CDC ושיטת המגע, חשיפה לקוטלי חרקים עשויה להשתנות בין שכפולים של אותה בדיקה. החרקים נחשפים לקוטלי חרקים המופצים בחלק הפנימי של בקבוק זכוכית (בדיקה ביולוגית של בקבוק CDC ושיטת מגע) או על ניירות ספוגים (בדיקת שפופרת של ארגון הבריאות העולמי). הריכוז של קוטל חרקים בשני המשטחים (זכוכית ונייר) ידוע וקבע מראש על ידי סינון מינים שונים של גנוטיפים ידועים. עם זאת, הכמות הזמינה לספיגה פוטנציאלית על ידי החרק יכולה להשתנות מאוד בהתאם לפני השטח שבהם נעשה שימוש, מרכיבי תערובת קוטל החרקים, ועד כמה קוטל החרקים מופץ באופן הומוגני על פני השטח16,17. בבדיקה הביולוגית של בקבוק ה-CDC, ציפוי קוטל החרקים בחלק הפנימי של הבקבוק תלוי בהליכים המופעלים על ידי כל מעבדה ומשתמש. בבדיקת הצינור של ארגון הבריאות העולמי, המאמרים שטופלו בקוטלי חרקים מיוצרים באופן מרכזי ולכן ככל הנראה הומוגניים למדי במעבדות. עם זאת, בבדיקת הצינור של ארגון הבריאות העולמי, צינור החשיפה מאפשר לדגימות לנחות ולנוח על רשת מתכת שאינה חשופה לקוטלי חרקים, מה שמוביל לחשיפה פוטנציאלית לקוטלי חרקים הטרוגניים בקרב הדגימות בתוך כל בדיקה. עדיין יש לחקור את הכמות האמיתית של קוטל החרקים שנאספה ונספגה על ידי דגימות בכל שיטה בהמשך18.
בנוסף, הבדיקה הביולוגית של בקבוק ה-CDC, בדיקת הצינור של ארגון הבריאות העולמי ושיטת המגע משמשים בדרך כלל כמבחני סף הבודקים רק ריכוז אחד קבוע מראש של קוטל חרקים. גישה זו יכולה לזהות במדויק את נוכחות ההתנגדות והיא בעלת ערך למעקב אחר התנגדות (במיוחד כאשר ההתנגדות מתפשטת). עם זאת, מבחני סף אינם יכולים לכמת את עוצמת ההתנגדות, מה שעשוי לנבא יותר את היעילות של כלי ההתערבות. אם משתמשים בריכוזי קוטל חרקים מרובים בשיטות אלה, ניתן להשתמש בהם כמבחני עוצמה. בדיקות אינטנסיביות עבור הבדיקה הביולוגית של בקבוק ה- CDC ובדיקת הצינור של ארגון הבריאות העולמי הוצגו על ידי בדיקת פי 5 ופי 10 המינונים המפלים שנקבעו מראש כדי לטפל בפער זה במעקב 6,19. בעוד שהם מספקים יכולת גדולה יותר להבדיל בין אוכלוסיות עמידות, 3-5 מינונים (קבועים מראש) מספקים רזולוציה מוגבלת לחישוב ריכוזים קטלניים. בנוסף, יתושים בגדלים שונים משמשים במבחנים כאלה. עם זאת, חשוב למדוד את המסה מכיוון שדגימות גדולות יותר עשויות להזדקק למינון גבוה יותר כדי להיהרג מכיוון שהמינון האפקטיבי ליחידת מסה יהיה נמוך בהרבה מזה של אורגניזם קטן יותר12. חישוב מינון קטלני בעל יחסות המונית (כמות קוטל החרקים לכל מסת חרקים) יהיה מדד שימושי יותר מהריכוז הקטלני הנפוץ יותר (למשל, כמות קוטל החרקים לכל שטח פנים) מכיוון שהוא בוחן את השונות של מסת החרקים בין מינים, אוכלוסיות וגנוטיפים. נתונים כאלה יסייעו למלא את הפער בין עמידות גנוטיפית ופנוטיפית במעבדה ובשטח, ויכולים גם לספק דרך קלה לחשב את ריכוז היישום הדרוש לטיפול באוכלוסייה של חרקים בעלי מסה ממוצעת ידועה.
השימוש במינונים קטלניים בעלי יחסות המונית שהורגים 50% מהדגימות (LD50) משלב גם כמה יתרונות אחרים. הערכת הרעילות של תרכובת מסוימת במ"ג/ק"ג (= ng/mg) היא סטנדרטית בטוקסיקולוגיה אנושית ווטרינרית14, וערכי LD50 נמצאים בגיליונות נתוני בטיחות חומרים. מינונים קטלניים מאפשרים גם השוואה ישירה של רעילות בין כימיקלים שונים כלפי מין מסוים או אותו כימיקל כלפי מינים שונים20, כמו גם הערכה איכותית של קוטלי חרקים וכימיקלים חדשים13. בנוסף, ה-LD50 יכול לספק יחסי התנגדות משמעותיים ומדויקים יותר מאלה הנגזרים מתוצאות תמותה מינון אבחוני, מה שעלול לגרום להערכת יתר של רמת העמידות הקיימת באוכלוסייה. לכן, בדיקה זו תתאים לתוכניות מעקב שגרתיות על ידי מתן ניטור עמידות קפדני יותר המבוסס על מינונים קטלניים של יחסות מסה הנגזרים מדגימות רבות יותר ממה שמומלץ לבדיקות ביולוגיות אחרות21.
שיטת היישום המקומית שימשה במעקב אחר רגישות לקוטלי חרקים אחר יתושים וזבובים כחלופה לבדיקות הביולוגיות הסטנדרטיות של רגישות לקוטלי חרקים כאשר העמידות כבר ידועה או חשודהב-22,23, כמו גם למעקב אחר חרקים מזיקים מסוימים24 כדי להעריך בצורה מדויקת יותר פרופילי עמידות ורעילות פנימית של קוטל חרקים21 . בבדיקות ביולוגיות של יישומים מקומיים, קוטל החרקים מוחל על כל אורגניזם, וכתוצאה מכך נוצרת שונות מינימלית בחשיפה לקוטלי חרקים. מאמר זה מציג שיטה מעט מותאמת ומשופרת המאפשרת ליישם את החשיפה לקוטלי חרקים על מספר רב של חרקים בפרק זמן קצר תוך שליטה במסת החרקים22. שיטה זו עם תפוקה גבוהה יותר עם רמות טובות של שכפול יכולה להיות כלי שימושי נוסף למעקב שגרתי אחר רגישות לקוטלי חרקים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>20A00L068</td>
			<td>Acetone aliquot storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL screw cap tubes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1182K23</td>
			<td>Insecticide dilution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>339651</td>
			<td>Insecticide dilution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0334125D</td>
			<td>Fruit fly weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 &#956;L syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14815288</td>
			<td>Topical applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423240040</td>
			<td>ACS 99.6%, 4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti (IICC strain)</td>
			<td>USDA CMAVE</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide resistant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti (Rockefeller strain)</td>
			<td>CDC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide susceptible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-557-409</td>
			<td>Precision up to 0.1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>6.49986E+11</td>
			<td>Mosquito collection device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89126-794</td>
			<td>Place under workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B092S8JVQN</td>
			<td>Use for sorting insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool balls</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B0769MKZWT</td>
			<td>Use for sucrose solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispenser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1482225</td>
			<td>Repeater pipettor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster (Canton-S strain)</td>
			<td>University of Wisconsin-Madison</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide susceptible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped paint brushes</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07KT2X1BK</td>
			<td>Use for sorting insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fruit fly stock bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS355</td>
			<td>Use for rearing and sorting fruit flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-held CO2 dispenser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1710679</td>
			<td>Use for knocking down insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding cups</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08DXG7V1S</td>
			<td>Clear plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice pack</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08QDWMMW5</td>
			<td>Use for knocking down fruit flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice trays</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>9301085269</td>
			<td>Use for knocking down insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect forceps</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07B4767WR</td>
			<td>Insect forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insecticide</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc</td>
			<td>45423-250MG</td>
			<td>Deltamethrin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling stickers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07Q4X9GWX</td>
			<td>3/4&#34; Color dot stickers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00X6A1GYK</td>
			<td>White tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netting</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07F2PHHWV</td>
			<td>Use for covering holding cups and insect handling tent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712H371</td>
			<td>100 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC Pipe</td>
			<td>Lowe&#8217;s</td>
			<td>23971</td>
			<td>Insect handling tent materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00006IBRU</td>
			<td>Use for securing mesh/net on cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01J78INO0</td>
			<td>Granulated White Sugar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12578-165</td>
			<td>4&#34; x 4&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

topical application bioassay to quantify insecticide toxicity for mosquitoes and fruit flies

המשך השימוש בקוטלי חרקים לבריאות הציבור ולחקלאות הוביל לעמידות נרחבת לקוטלי חרקים ולפגיעה בשיטות ההדברה. מעקב אחר עמידות לקוטלי חרקים אחר אוכלוסיות יתושים נעשה בדרך כלל באמצעות בדיקות ביולוגיות של בקבוקים של המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן (CDC) או בדיקות צינור של ארגון הבריאות העולמי (WHO). עם זאת, שיטות אלה יכולות לגרום לרמה גבוהה של שונות בנתוני התמותה עקב מגע משתנה של קוטל חרקים עם החרק, מספר קטן יחסית של אורגניזמים שנבדקו, שונות נרחבת במסה בין אוכלוסיות ותנאי סביבה משתנים ללא הרף, מה שמוביל לתוצאות משתנות. מאמר זה מציג את היישום האקטואלי bioassay, המותאם כמאמר ביו-אסאיפי פנוטיפי בעל תפוקה גבוהה הן עבור יתושים והן עבור זבובי פירות, כדי לבחון מספר רב של חרקים לאורך מגוון של ריכוזי קוטל חרקים.
בדיקה זו 1) מבטיחה טיפול עקבי ומגע עם קוטל חרקים עם כל אורגניזם, 2) מייצרת עקומות מינון-תגובה ספציפיות ביותר המביאות בחשבון את ההבדלים במסה הממוצעת בין זנים ומינים (החשובה במיוחד עבור אורגניזמים שנאספו בשדה), ו-3) מאפשרת חישוב של מינונים קטלניים חציוניים קפדניים סטטיסטית (LD50 ), אשר נחוצים להשוואות יחס התנגדות - גישת מעקב חלופית מתמותה מינון אבחוני, המשמשת גם למעקב אחר עמידות בפני זחלים. בדיקה זו תהיה כלי משלים לפנוטיפ מדויק של אוכלוסיות יתושים, וכפי שהודגם באמצעות זבובי פירות, היא ניתנת להתאמה בקלות לשימוש עם חרקים אחרים. אנו טוענים כי בדיקה זו תסייע למלא את הפער בין עמידות גנוטיפית לקוטלי חרקים פנוטיפיים במספר מיני חרקים.

תוצאות מייצגות אלה כוללות שני זנים שונים של Ae. aegypti, Rockefeller (ROCK), וזן שדה מבודד מפלורידה עם מוטציות ידועות של עמידות בפני נפילות F1534C ו-V1016I (גנוטיפ IICC). בנוסף, דרוזופילה מלנוגסטר (קנטון: זן S) מופיע.
איור 2 ואיור 3 ממחישים את תגובת המינון של כל אורגניזם לפי זן ומין שנבדקו על פי הפרוטוקול לעיל. מכיוון שלא נצפו הבדלים בין עקומות תגובת המינון של יתושים זכרים ונקבות בתוך כל זן (t = 1.70, p = 0.098 עבור ROCK ו- t = 0.64, p = 0.527 עבור IICC), נאספו נתונים משני המינים בתוך כל זן יתושים. LD50 בעל יחסות מסה עבור ROCK ו- IICC הם 0.008 ננוגרם /מ"ג (95% CI: 0-0.104) ו- 0.336 ננוגרם /מ"ג (95% CI: 0.235-0.438), בהתאמה. 95% CIs של ערכים אלה אינם חופפים, מה שמצביע על תגובות מינון שונות באופן משמעותי של הזנים. ה- RR של זן IICC (ביחס לזן ROCK) הוא 41.7, אשר על פי ארגון הבריאות העולמי, נחשב עמיד מאוד5. עבור זבובי הפירות של קנטון-S, ה-LD50 בעל יחסות המסה הוא 0.213 ננוגרם/מ"ג (95% CI: 0-0.490).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig02.jpg"> איור 2: נתונים מייצגים של יתושים באמצעות בדיקה ביולוגית של יישומים מקומיים. נתוני מינון-תגובה מייצגים ממחקר ביולוגי של יישום מקומי בעקבות הפרוטוקול הנ"ל באמצעות deltamethrin ויתושים: (A) נקבה Ae. aegypti ROCK (n = 880) ו- IICC (n = 550) זנים, (B) זכר Ae. aegypti ROCK (n = 880) ו- IICC (n = 569) זנים. ריכוזי בדיקת דלתאמתרין נעו בין 0.00075 ng/μL ל-9.68705 ng/μL, והמינון של deltamethrin המיושם (ng) לכל מסה ממוצעת של יתוש (mg) משתקף בציר ה-x. התמותה מוצגת כשיעור על ציר ה-y. הקו השחור דרך כל אשכול נקודות נתונים מייצג את הרגרסיה הליניארית הספציפית לזן ולמין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig03.jpg"> איור 3: נתונים מייצגים של זבובי פירות באמצעות בדיקה ביולוגית של יישומים מקומיים. נתוני תגובת מינון מייצגים מבדיקה ביולוגית של יישום מקומי בעקבות הפרוטוקול הנ"ל באמצעות דלתאמתרין וזבובי פירות: זן D. melanogaster Canton-S (n = 1014). ריכוזי בדיקת דלתאמתרין נעו בין 0.00499 ל-5.02876 ננוגרם/מיקרול, והמינון של דלתאמתרין שנמרח (ng) למסת זבוב הפירות הממוצעת (מ"ג) משתקף בציר ה-x. התמותה מוצגת כשיעור על ציר ה-y. הקו השחור מייצג את הרגרסיה הליניארית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
איור משלים S1: אוהל לטיפול בחרקים על הספסל. אוהל לטיפול בחרקים על הספסל משמש ללכידה קלה יותר של יתושים נמלטים או זבובים במהלך בדיקת היישום המקומית. המבנה סגור ב-A ופתוח ב-B. מבנה זה נבנה עם צינור PVC ובד רשת עדין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure1.Final.V1.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים S2: מזרק ויחידת אפליקטור מהדר. מזרק ויחידת אפליקטור מהדר המשמשת למינון חרקים. החלקים העיקריים כוללים 1) מחט, 2) חבית מזרק, 3) בוכנה, 4) מהדר, ו 5) כפתור מהדר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure2.Final.V1.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 1: סקריפט אקראיות: סקריפט אקראי ליצירת תוויות לא מוטות עבור כל הכוסות של כל ניסוי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File1_Randomization.Script.Final.V1.docx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 2: גיליון ציוני תמותה: גיליון ציוני תמותה המסייע להערכת תמותה. הגיליון כולל גם מקומות לתיעוד כל המידע החשוב האחר לתיעוד, כפי שמצוין בפרוטוקול, כגון יישום קוטל החרקים בשעות ההתחלה והסיום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File2_Mortality.Score.Sheet.Final.V1%20(1).docx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 3: נתוני תמותה לדוגמה: קובץ נתונים לדוגמה המשמש ליצירת איור 2. תיאורי כותרות העמודות הם כדלקמן: "id" = קוד זיהוי של כל נקודת נתונים; "מינים" = שם המין (למשל, Aedes aegypti); "קוטל חרקים" = שם של קוטל חרקים המיושם באופן מקומי (למשל, Deltamethrin); "זן" = שם זן היתושים (למשל, ROCK); "תאריך" = תאריך התחלה יישום אקטואלי; "סקס" = מין של יתושים; "גיל" = גיל היתושים (צעירים = בני 3-5 ימים; זקנים = בני 4 שבועות); "total.mosq" = המספר הכולל של יתושים ששוקלים באצווה; "משקל" = משקל (מ"ג) של כל היתושים בתוך אצווה; "ריכוז" = ריכוז קוטל חרקים (מיקרוגרם/מ"ל); "מזרק" = נפח טיפות (mL) של מזרק; "מינון" = כמות החומר הפעיל של קוטל חרקים המופעל על כל יתוש (ng); "סה"כ" = מספר היתושים בכל כוס; מת = מספר היתושים המתים בכל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File3_Example.Data.Final.V1%20(1).txt" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 4: קוד ניתוח R: קוד R לדוגמה שניתן להשתמש בו כדי להשלים את ניתוח Probit (כמתואר בשלב 8 של הפרוטוקול). ניתן להשתמש בתוצאות המייצגות (הנגישות באמצעות קובץ הנתונים המשלים לדוגמה) באמצעות קוד R זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File4.Final.V3%20(1).R" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies at JoVE.com

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

אנו מתארים את המתודולוגיה והחשיבות של היישום האקטואלי bioassay למדידת רגישות לקוטלי חרקים אצל יתושים וזבובי פירות. הבדיקה המוצגת היא בעלת תפוקה גבוהה, משתמשת במסת חרקים - ובכך מאפשרת לחשב מינון קטלני בעל יחסות מסה במקום ריכוז - וסביר להניח שיש לה שונות נמוכה יותר משיטות דומות אחרות.

יישום אקטואלי Bioassay כדי לכמת רעילות קוטל חרקים עבור יתושים וזבובי פירות

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

על ידי יישום ישיר של קוטל חרקים על החרק ולא דרך מגע על פני השטח, יש שונות מינימלית בחשיפה לקוטלי חרקים, וזה מאפשר לנו למדוד את פרופיל הרגישות של אוכלוסיות יתושים בצורה מדויקת יותר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו לחשב מינונים קטלניים של קוטל חרקים ולא ריכוזים קטלניים, מה שמשפר מאוד את ההשוואות של יחסי ההתנגדות. הקפידו לאחסן את קוטלי החרקים כראוי, הימנעו מזיהום הכלים שלכם וודאו שחלקי המזרק במצב טוב.זה יעזור לך להשיג תוצאות עקביות. כדי להתחיל, להסיר את פתרונות קוטל החרקים הדרושים מן המקפיא. מיד מערבולת את התמיסה או הופכת חמש פעמים, ומניחים אותה במיכל עמיד בפני אור בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לקוטלי החרקים להתחמם לטמפרטורת החדר לפני השימוש.הגדר חמישה צינורות microcentrifuge עם 0.5 מיליליטר של אצטון כל אחד. מלאו את חבית המזרק לחלוטין באצטון מהצינור הראשון. לאחר מכן הוציאו את האצטון למיכל פסולת על ידי דחיפה מהירה כלפי מטה על הבוכנה, וחזרו על הפעולה ארבע פעמים נוספות כדי להשלים בסך הכל חמש שטיפות אצטון מאותו אצטון אליקוט.לאחר מכן, מלאו את חבית המזרק לחלוטין באוויר, והוציאו את שאריות האוויר והאצטון הפוטנציאלי לתוך מיכל הפסולת. חזרו על הפעולה פעמיים נוספות כדי להשלים שלוש שטיפות באוויר. צור כיס אוויר בתוך הקנה בין בוכנת המזרק לחלק העליון של המחט על ידי משיכת הבוכנה כחמישה מילימטרים לתוך הקנה.סמן את כוסות ההחזקה מפלסטיק עם תעודת הזהות האקראית להערכת תמותה עיוורת. באמצעות שאיפה המופעלת על ידי יניקה משאיפה, שאפו למספר הרצוי של יתושים בוגרים בני שלושה עד חמישה ימים. מניחים את קצה השואף לתוך הצינור עם כותנה עטופה סביב הקצה.נשפו בעדינות, והקש על השואף כדי להעביר את היתושים לצינור חרוטי. השתמש בכותנה כדי לחבר את הצינור כאשר קצה השואף מוסר, ולאחר מכן מכסה עם המכסה. להפיל לזמן קצר את היתושים בצינורות על ידי הנחתם למשך 10 דקות לפחות בארבע מעלות צלזיוס או לקבור אותם מתחת לקרח במגש קרח.העבירו את היתושים שהופלו לאוהל הטיפול בחרקים. הפנו בזהירות את היתושים אל מגש פלסטיק המונח על הקרח, ושפכו כ-50 יתושים בכל פעם כדי לוודא שכל אחד מהם נוגע במגש הקריר שמתחתיו ונשאר מופל. מיין את היתושים לפי מין על ידי הרמתם בעדינות על ידי הרגליים או הכנפיים עם מלקחיים, ולאחר מכן הנחת כל מין לתוך החזקה נפרדת, ולעצור כאשר המספר הרצוי מגיע.בעת המיון, יש להסיר יתושים שנפצעו או שהם גדולים או קטנים במיוחד. כדי לרשום את משקלה של היתושים, הניחו ריקה עם צלחת פטרי כמכסה על המאזניים, ותארו את המאזניים. יוצקים את היתושים לתוך המיכל, ומניחים את המכסה על גבי.מניחים את המיכל על הסולם, ורושמים את המשקל הסופי, יחד עם מספר היתושים. מיד הניחו את הדגימות בחזרה על הקרח כדי להשאיר אותן משותקות עד שכל כוסות הדגימה נשקלו. מחלקים את היתושים המוכנים לחמש עד עשר כוסות נפרדות המונחות על קרח, המסומנות בתעודות זהות אקראיות.השתמשו בפינצטה ובמטען כף יד כדי להשיג 20 עד 25 יתושים לכוס. כדי למיין את זבובי הפירות, מרדימים את הזבובים באמצעות פחמן דו חמצני למשך שבע שניות. יוצקים את הזבובים על חבילת קרח עטופה בנייר ספסל.באמצעות מכחול בעל קצה דק, מפרידים וסופרים את הזכרים והנקבות. השתמשו במכחול כדי לאסוף בעדינות את הזבובים שנבחרו, והכניסו אותם לבקבוק מלאי נקי וריק. לאחר בחירת מספר שווה של זבובי פירות זכרים ונקבות, סמן את בקבוקי המניות בשם הזן ובסך הכל בזבוב הפירות.מרדימים את בקבוק זבובי הפירות באמצעות פחמן דו חמצני למשך שבע שניות. יוצקים את זבובי הפירות על נייר שקילה, ומשתמשים בנייר כמשפך כדי להכניס את הזבובים לבקבוקון מזויף המסומן בתעודת זהות אקראית.לאחר הנחת מכסה צלחת הפטרי על גבי בקבוקון זבובי הפירות, הניחו אותו על המאזניים. רשום את המשקל המשולב ומספר הדגימות בגיליון הציונים.מיד מניחים את בקבוקון זבובי הפירות במגש קרח כשהמכסה עדיין למעלה כדי למנוע מהזבובים לברוח. טען את המזרק בריכוז קוטל החרקים הנכון, החל מהמינון הכי פחות מרוכז ועבוד לקראת המינון המרוכז ביותר עם כל קבוצת אורגניזמים. הטה את הדגימות על נייר שקילה המונח על גבי מגש על הקרח.הפרד את הדגימות הקרובות זו לזו באמצעות מכחול נקי ללא קוטל חרקים או צמר גפן כדי לאפשר גישה נוחה לכל דגימה לצורך מינון. באמצעות המזרק, יש למרוח טיפה אחת של תמיסת קוטל חרקים על בית החזה הגחוני ואזור הבטן עבור יתושים ואת הדורסום עבור זבובי פירות. מיד לשפוך את הדגימות בחזרה לתוך פלסטיק מסומן.מכסים את הכוס ברשת וגומייה. שימו לב לספירת דגימות מעודכנת על הגביע אם דגימות כלשהן נהרגו, ניזוקו או נמלטו בתהליך זה. מניחים את הכוס שהושלמה לתוך מגש החזקה.עבור הגביע הראשון, רשמו את הזמן שבו הושלמה המינון. חזרו על המינון של כל עד שכל הדגימות מינונו עם ריכוזי קוטל החרקים המתאימים, ותעדו את זמן הסיום שבו כל הדגימות נוספו. ספקו תמיסת 10% סוכרוז לכל באמצעות כדור צמר גפן רטוב, ואחסנו את היתושים וזבובי הפירות בטמפרטורה ובלחות הרצויות.שיא תמותת הדגימות ב-24 שעות לאחר תחילת החשיפה לקוטלי חרקים. לסווג יתושים כחיים אם הם יכולים לעוף ולהחזיק את עצמם זקופים ומתים אם הם חסרי תנועה או אטקסיים, כפי שתואר על ידי ארגון הבריאות העולמי. בצע את אותה הערכת תמותה עבור זבובי פירות.לאחר ביצוע הבדיקה הביולוגית, התקבלו נתוני תגובת מינון הכוללים שני זנים שהם רוקפלר וגנוטיפ IICC עבור הזכר והנקבה Aedes aegypti. המינון הקטלני החציוני של רוקפלר ו-IICC היה 0.008 ו-0.336 ננוגרם למיליגרם, בהתאמה. התוצאות לא חשפו הבדלים בין עקומות תגובת המינון של יתושים נקביים וזכריים בתוך כל זן.לכן, נתונים משני המינים שולבו כדי לחשב את ערכי המינון הקטלני החציוני. מכיוון שהמרווחים בר-סמך של 95% עבור המינון הקטלני החציוני של שני זנים אלה לא חפפו, ערכים אלה נחשבו שונים באופן משמעותי. בנוסף, כאשר מחשבים את היחסים העמידים, זן ה-IICC היה עמיד יותר מפי 40 מזן הרוקפלר הרגיש.התקבלו גם נתוני תגובת מינון עבור זבוב הפירות, Drosophila melanogaster, זן Canton-S, והמינון החציוני הקטלני של יחסות המסה נמצא כ-0.213 ננוגרם למיליגרם. עקביות היא קריטית, במיוחד בעת אחסון ויישום קוטל החרקים והערכת התמותה. כמו כן, יש לדאוג בעת הטיפול בדגימה כדי למנוע נזק או מוות שאינם נגרמים על ידי קוטל החרקים.בשיטה זו, אנו יכולים כעת לקבוע במדויק את העמידות הטכנית של אוכלוסיית יתושים וכיצד תנאים סביבתיים משפיעים על העמידות או כיצד עמידות טכנית מנבאת עמידות מעשית.