Questa ricerca è stata supportata da un premio CAREER dalla National Science Foundation a SH con il numero di 2047572. Ringraziamo Damien Rivera per la sua assistenza nell'allevamento di moscerini della frutta e nella preparazione per il test di applicazione topica, il Dr. Ganetzky presso l'Università del Wisconsin-Madison per aver condiviso il suo ceppo di moscerino della frutta Canton-S, i Centers for Disease Control and Prevention per la condivisione del ceppo Rockefeller e il Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti Center for Medical Agricultural and Veterinary Entomology per la condivisione del ceppo isoline IICC. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Le zanzare sono responsabili di oltre 700.000 morti ogni anno a causa delle malattie che trasmettono agli esseri umani, con oltre la metà di quelle morti dovute alla sola malaria1. Il principale metodo preventivo contro la trasmissione della malaria e di altre malattie trasmesse da vettori è l'uso di insetticidi, spesso sotto forma di reti insetticide di lunga durata o irrorazione residua interna2. Tuttavia, la resistenza agli insetticidi è diffusa tra le zanzare e altri insetti vettori, così come i parassiti agricoli 3,4. Per gestire efficacemente la resistenza, la sorveglianza è di fondamentale importanza5. Per questo, sono necessari metodi di rilevamento della resistenza altamente accurati e ad alta produttività. Attualmente, gli strumenti di sorveglianza della resistenza agli insetticidi più diffusi per le zanzare sono il test del tubo dell'OMS6 e il biotest della bottiglia del CDC7. Per i moscerini della frutta il metodo di applicazione del contatto residuo (simile al biotest della bottiglia CDC) è un biodosaggio insetticida comunemente usato 8,9,10. Tuttavia, la variabilità nei dati di questi metodi è in genere elevata, con misurazioni dello stesso ceppo di zanzara di laboratorio che vanno da ~ 20-70% di mortalità nei saggi di bottiglia CDC e 0-50% nei test in prove in prove dell'OMS quando esposti a dosaggi subletali11. Tale variazione è sorprendente perché la limitata variazione genetica nella maggior parte dei ceppi di laboratorio dovrebbe portare a una limitata variazione della suscettibilità agli insetticidi nella popolazione. Tuttavia, c'è ancora un alto livello di variazione osservato nei risultati del biotest.
Le potenziali fonti di questa variazione potrebbero essere il risultato di un'esposizione eterogenea agli insetticidi tra campioni all'interno del biotest a causa dell'esposizione indiretta agli insetticidi attraverso la superficie, degli effetti ambientali eterogenei, della normale variazione biologica tra individui dello stesso genotipo e della variazione della massa di campioni della stessa popolazione12 . Un metodo usato raramente con una replicabilità più elevata è il biotest di applicazione topica. In questo test, l'insetticida viene applicato direttamente a ciascun insetto13,14, rimuovendo il fattore di esposizione eterogenea di diversi campioni all'interno dello stesso test. Tuttavia, a causa della natura a lenta produttività di questo metodo, non viene utilizzato abitualmente come strumento di sorveglianza della suscettibilità agli insetticidi per le popolazioni di zanzare. Questo documento presenta un protocollo modificato per il biotest di applicazione topica che consente esposizioni a più alto rendimento, correggendo anche la variazione della massa degli insetti, un parametro correlato ai cambiamenti nella suscettibilità agli insetticidi12. Una riduzione del rumore e della variazione associata alla massa dei dati di mortalità da esposizione variabile agli insetticidi consentirebbe una sorveglianza tecnica della resistenza più accurata11,15. Tali dati potrebbero essere utilizzati per associare più accuratamente la resistenza fenotipica con marcatori genetici, parametri di fitness e/o competenza vettoriale. Inoltre, dimostriamo come questo test potrebbe essere facilmente adattato ad altre specie di insetti utilizzando il biotest di applicazione topica sui moscerini della frutta, una specie di insetti di corpo più piccolo.
Il limite principale delle suddette applicazioni di contatto residuo è che l'esposizione agli insetticidi può variare da campione a campione all'interno dello stesso test. Nel caso dei biosaggi delle bottiglie CDC e del metodo di contatto, l'esposizione agli insetticidi può variare tra le repliche dello stesso test. Gli insetti sono esposti a insetticidi che vengono distribuiti all'interno di una bottiglia di vetro (cdc bottle bioassay e metodo di contatto) o su carte impregnate (test della sonda dell'OMS). La concentrazione di insetticida su entrambe le superfici (vetro e carta) è nota e predeterminata mediante lo screening di diverse specie di genotipi noti. Tuttavia, la quantità disponibile per essere potenzialmente assorbita dall'insetto può variare notevolmente a seconda della superficie utilizzata, dei componenti della miscela di insetticidi e di quanto omogeneamente l'insetticida è distribuito sul materiale superficiale16,17. Nel biotest della bottiglia CDC, il rivestimento insetticida all'interno della bottiglia dipende dalle procedure utilizzate da ciascun laboratorio e utente. Nel test su provetta dell'OMS, le carte trattate con insetticida sono prodotte centralmente e quindi molto probabilmente abbastanza omogenee tra i laboratori. Tuttavia, nel test della sonda dell'OMS, il tubo di esposizione consente ai campioni di atterrare e riposare su reti metalliche non esposte a insetticidi, portando a una potenziale esposizione eterogenea agli insetticidi tra i campioni all'interno di ciascun test. La quantità effettiva di insetticida raccolto e assorbito dai campioni attraverso ciascun metodo deve ancora essere esplorata ulteriormente18.
Inoltre, il biotest della bottiglia CDC, il test della sonda dell'OMS e il metodo di contatto sono più comunemente usati come saggi di soglia che testano solo una concentrazione di insetticida predeterminata. Questo approccio può rilevare con precisione la presenza di resistenza ed è prezioso per la sorveglianza della resistenza (specialmente quando la resistenza si sta diffondendo). Tuttavia, i saggi di soglia non possono quantificare la forza della resistenza, che potrebbe essere più predittiva dell'efficacia degli strumenti di intervento. Se vengono utilizzate più concentrazioni di insetticidi con questi metodi, possono essere utilizzate come saggi di intensità. I saggi di intensità per il biosasaggio della bottiglia CDC e il test della sonda dell'OMS sono stati introdotti testando 5x e 10 volte i dosaggi discriminanti predeterminati per affrontare questa lacuna nella sorveglianza 6,19. Pur fornendo una maggiore capacità di distinguere tra popolazioni resistenti, 3-5 dosaggi (predeterminati) forniscono una risoluzione limitata per calcolare le concentrazioni letali. Inoltre, zanzare di varie dimensioni sono utilizzate in tali test. Tuttavia, la massa è importante da misurare in quanto i campioni più grandi potrebbero aver bisogno di una dose più elevata per essere uccisi poiché la dose efficace per unità di massa sarà molto inferiore a quella di un organismo più piccolo12. Il calcolo di una dose letale relativizzata di massa (quantità di insetticida per massa di insetto) sarebbe una metrica più utile rispetto alla più comune concentrazione letale (ad esempio, quantità di insetticida per superficie) in quanto considera la variazione della massa degli insetti tra sessi, popolazioni e genotipi. Tali dati contribuirebbero a colmare il divario tra resistenza genotipica e fenotipica all'interno del laboratorio e del campo e potrebbero anche fornire un modo semplice per calcolare la concentrazione di applicazione necessaria per trattare una popolazione di insetti di massa media nota.
L'uso di dosaggi letali relativizzati alla massa che uccidono il 50% dei campioni (LD50) incorpora anche molti altri benefici. La valutazione della tossicità di un composto specifico in mg/kg (= ng/mg) è standard nella tossicologia umana e veterinaria14 e i valori di DL50 si trovano nelle schede di sicurezza dei materiali. I dosaggi letali consentono anche il confronto diretto della tossicità tra diverse sostanze chimiche verso una particolare specie o la stessa sostanza chimica verso diverse specie20, nonché una valutazione di alta qualità di nuovi insetticidi e sostanze chimiche13. Inoltre, la LD50 può fornire rapporti di resistenza più significativi e accurati rispetto a quelli derivati dai risultati diagnostici di mortalità della dose, che possono comportare una sovrastima del livello di resistenza presente in una popolazione. Pertanto, questo test sarebbe adatto per i programmi di sorveglianza di routine fornendo un monitoraggio della resistenza più rigoroso basato su dosi letali relativizzate alla massa derivate da più campioni di quanto raccomandato per altri saggi biologici21.
Il metodo di applicazione topica è stato utilizzato nella sorveglianza della suscettibilità agli insetticidi per zanzare e mosche come alternativa ai biotest standard di suscettibilità agli insetticidi quando la resistenza è già nota o sospetta22,23, nonché per la sorveglianza in alcuni insetti nocivi24 per valutare più accuratamente i profili di resistenza e la tossicità intrinseca degli insetticidi21 . Nei biosaggi di applicazione topica, l'insetticida viene applicato a ciascun organismo, con conseguente variazione minima nell'esposizione all'insetticida. Questo documento presenta un metodo leggermente adattato e migliorato che consente di applicare l'esposizione agli insetticidi a un gran numero di insetti in un breve periodo, controllando anche la massa degli insetti22. Questo metodo a più alto rendimento con buoni livelli di replicabilità potrebbe essere un utile strumento aggiuntivo per la sorveglianza di routine della suscettibilità agli insetticidi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>20A00L068</td>
			<td>Acetone aliquot storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL screw cap tubes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1182K23</td>
			<td>Insecticide dilution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>339651</td>
			<td>Insecticide dilution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0334125D</td>
			<td>Fruit fly weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 &#956;L syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14815288</td>
			<td>Topical applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423240040</td>
			<td>ACS 99.6%, 4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti (IICC strain)</td>
			<td>USDA CMAVE</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide resistant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti (Rockefeller strain)</td>
			<td>CDC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide susceptible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-557-409</td>
			<td>Precision up to 0.1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>6.49986E+11</td>
			<td>Mosquito collection device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89126-794</td>
			<td>Place under workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B092S8JVQN</td>
			<td>Use for sorting insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool balls</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B0769MKZWT</td>
			<td>Use for sucrose solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispenser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1482225</td>
			<td>Repeater pipettor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster (Canton-S strain)</td>
			<td>University of Wisconsin-Madison</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide susceptible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped paint brushes</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07KT2X1BK</td>
			<td>Use for sorting insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fruit fly stock bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS355</td>
			<td>Use for rearing and sorting fruit flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-held CO2 dispenser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1710679</td>
			<td>Use for knocking down insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding cups</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08DXG7V1S</td>
			<td>Clear plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice pack</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08QDWMMW5</td>
			<td>Use for knocking down fruit flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice trays</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>9301085269</td>
			<td>Use for knocking down insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect forceps</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07B4767WR</td>
			<td>Insect forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insecticide</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc</td>
			<td>45423-250MG</td>
			<td>Deltamethrin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling stickers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07Q4X9GWX</td>
			<td>3/4&#34; Color dot stickers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00X6A1GYK</td>
			<td>White tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netting</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07F2PHHWV</td>
			<td>Use for covering holding cups and insect handling tent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712H371</td>
			<td>100 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC Pipe</td>
			<td>Lowe&#8217;s</td>
			<td>23971</td>
			<td>Insect handling tent materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00006IBRU</td>
			<td>Use for securing mesh/net on cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01J78INO0</td>
			<td>Granulated White Sugar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12578-165</td>
			<td>4&#34; x 4&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

topical application bioassay to quantify insecticide toxicity for mosquitoes and fruit flies

L'uso continuato di insetticidi per la salute pubblica e l'agricoltura ha portato a una diffusa resistenza agli insetticidi e all'ostacolo dei metodi di controllo. La sorveglianza della resistenza agli insetticidi delle popolazioni di zanzare viene in genere effettuata attraverso i test biologici delle bottiglie dei Centers for Disease Control and Prevention (CDC) o i test su sondi dell'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS). Tuttavia, questi metodi possono comportare un alto grado di variabilità nei dati di mortalità a causa del contatto variabile dell'insetticida con l'insetto, del numero relativamente piccolo di organismi testati, dell'ampia variazione di massa tra le popolazioni e delle condizioni ambientali in costante cambiamento, portando a risultati variabili. Questo documento presenta il biotest di applicazione topica, adattato come biotest fenotipico ad alto rendimento sia per le zanzare che per i moscerini della frutta, per testare un gran numero di insetti lungo una gamma di concentrazioni di insetticidi.
Questo saggio 1) garantisce un trattamento coerente e il contatto insetticida con ogni organismo, 2) produce curve dose-risposta altamente specifiche che tengono conto delle differenze di massa media tra ceppi e sessi (che è particolarmente importante per gli organismi raccolti sul campo) e 3) consente il calcolo di dosi letali mediane statisticamente rigorose (LD50 ), che sono necessari per il confronto del rapporto di resistenza: un approccio di sorveglianza alternativo dalla mortalità diagnostica della dose, che viene utilizzato anche per la sorveglianza della resistenza ai larvicidi. Questo test sarà uno strumento complementare per fenotipizzare accuratamente le popolazioni di zanzare e, come illustrato utilizzando moscerini della frutta, è facilmente adattabile per l'uso con altri insetti. Sosteniamo che questo test aiuterà a colmare il divario tra resistenza agli insetticidi genotipica e fenotipica in più specie di insetti.

Questi risultati rappresentativi presentano due diversi ceppi di Ae. aegypti, Rockefeller (ROCK), e un ceppo di campo isolato della Florida con mutazioni note di resistenza al knockdown F1534C e V1016I (genotipo IICC). Inoltre, è presente la Drosophila melanogaster (ceppo Canton: S).
La Figura 2 e la Figura 3 illustrano la dose-risposta di ciascun organismo per ceppo e sesso testato seguendo il protocollo di cui sopra. Poiché non sono state osservate differenze tra le curve dose-risposta delle zanzare maschio e femmina all'interno di ciascun ceppo (t = 1,70, p = 0,098 per ROCK e t = 0,64, p = 0,527 per IICC), sono stati raggruppati i dati di entrambi i sessi all'interno di ciascun ceppo di zanzara. La LD50 relativizzata alla massa per ROCK e IICC sono rispettivamente 0,008 ng/mg (IC 95%: 0-0,104) e 0,336 ng/mg (IC 95%: 0,235-0,438). Gli IC al 95% di questi valori non si sovrappongono, indicando risposte alla dose significativamente diverse dei ceppi. Il RR del ceppo IICC (relativo al ceppo ROCK) è 41.7, che secondo l'OMS, è considerato altamente resistente5. Per i moscerini della frutta cantonali, la LD50 relativizzata in massa è 0,213 ng/mg (IC 95%: 0-0,490).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig02.jpg"> Figura 2: Dati rappresentativi delle zanzare che utilizzano il biotest di applicazione topica. Dati rappresentativi dose-risposta da biotest di applicazione topica secondo il protocollo di cui sopra utilizzando deltametrina e zanzare: (A) ceppi femmina Ae. aegypti ROCK (n = 880) e IICC (n = 550), (B) maschio Ae. aegypti ROCK (n = 880) e IICC (n = 569) ceppi. Le concentrazioni di test della deltametrina variavano da 0,00075 ng / μL a 9,68705 ng / μL e la dose di deltametrina applicata (ng) per massa media della zanzara (mg) si riflette sull'asse x. La mortalità è mostrata come proporzione sull'asse y. La linea nera attraverso ciascun cluster di punti dati rappresenta la deformazione e la regressione lineare specifica del sesso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig03.jpg"> Figura 3: Dati rappresentativi dei moscerini della frutta che utilizzano il biotest di applicazione topica. Dati rappresentativi dose-risposta da biotest di applicazione topica secondo il protocollo di cui sopra utilizzando deltametrina e moscerini della frutta: ceppo D. melanogaster Canton-S (n = 1014). Le concentrazioni dei test della deltametrina variavano da 0,00499 a 5,02876 ng / μL e la dose di deltametrina applicata (ng) per massa media del moscerino della frutta (mg) si riflette sull'asse x. La mortalità è mostrata come proporzione sull'asse y. La linea nera rappresenta la regressione lineare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura supplementare S1: Tenda per la gestione degli insetti da banco. La tenda per la manipolazione degli insetti da banco viene utilizzata per una più facile cattura di zanzare o mosche in fuga durante il test di applicazione topica. La struttura è chiusa in A e aperta in B. Questa struttura è stata costruita con tubo in PVC e tessuto a maglie fini. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure1.Final.V1.pdf" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare S2: Unità applicatore di siringhe e ripetitori. Unità di applicazione della siringa e del ripetitore utilizzata per il dosaggio degli insetti. Le parti principali includono 1) ago, 2) canna della siringa, 3) stantuffo, 4) ripetitore e 5) pulsante del ripetitore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure2.Final.V1.pdf" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 1: script di randomizzazione: Script di randomizzazione per creare etichette non distorte per tutte le tazze di ogni esperimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File1_Randomization.Script.Final.V1.docx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 2: Foglio di punteggio di mortalità: Foglio di punteggio di mortalità per aiutare la valutazione della mortalità. Il foglio include anche luoghi in cui registrare tutte le altre informazioni importanti da registrare, come indicato nel protocollo, come l'inizio e la fine dell'applicazione dell'insetticida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File2_Mortality.Score.Sheet.Final.V1%20(1).docx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 3: Esempio di dati sulla mortalità: File di dati di esempio utilizzato per creare la Figura 2. Le descrizioni delle intestazioni di colonna sono le seguenti: "id" = codice identificativo di ciascun punto dati; "specie" = nome della specie (ad esempio, Aedes aegypti); "insetticida" = nome dell'insetticida applicato localmente (ad esempio, Deltametrina); "ceppo" = nome del ceppo di zanzara (ad esempio, ROCK); "date" = data di inizio applicazione topica; "sesso" = sesso delle zanzare; "età" = età delle zanzare (giovani = 3-5 giorni; vecchi = 4 settimane); "total.mosq" = numero totale di zanzare pesate in batch; "peso" = peso (mg) di tutte le zanzare all'interno del lotto; "concentrazione" = concentrazione di insetticida (μg/mL); "siringa" = volume di goccioline (mL) della siringa; "dose" = quantità di principio attivo insetticida applicato a ciascuna zanzara (ng); "totale" = numero di zanzare in ogni tazza; "morto" = numero di zanzare morte in ogni tazza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File3_Example.Data.Final.V1%20(1).txt" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 4: Codice di analisi R: Esempio di codice R che può essere utilizzato per completare l'analisi Probit (come descritto nel passaggio 8 del protocollo). I risultati rappresentativi (accessibili tramite il file di dati di esempio supplementare) possono essere utilizzati con questo codice R. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File4.Final.V3%20(1).R" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies at JoVE.com

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

Descriviamo la metodologia e l'importanza del biotest di applicazione topica per misurare la suscettibilità agli insetticidi nelle zanzare e nei moscerini della frutta. Il test presentato è ad alto rendimento, utilizza la massa degli insetti, consentendo così di calcolare una dose letale relativizzata alla massa anziché la concentrazione, e probabilmente ha una variabilità inferiore rispetto ad altri metodi simili.

Biotest di applicazione topica per quantificare la tossicità degli insetticidi per zanzare e moscerini della frutta

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

Applicando direttamente l'insetticida sull'insetto piuttosto che attraverso il contatto superficiale, c'è una variazione minima nell'esposizione agli insetticidi e questo ci consente di misurare il profilo di suscettibilità delle popolazioni di zanzare in modo più accurato. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ci consente di calcolare le dosi letali relativizzate in massa di un insetticida piuttosto che le concentrazioni letali, il che migliora notevolmente i confronti del rapporto di resistenza. Fare attenzione a conservare correttamente gli insetticidi, evitare di contaminare gli strumenti e assicurarsi che le parti della siringa siano in buone condizioni.Questo ti aiuterà a ottenere risultati coerenti. Per iniziare, rimuovere le soluzioni insetticide necessarie dal congelatore. Ruotare immediatamente la soluzione o invertire cinque volte e metterla in un contenitore resistente alla luce a temperatura ambiente per lasciare che gli insetticidi si scaldino a temperatura ambiente prima dell'uso.Disporre cinque tubi di microcentrifuga con 0,5 millilitri di acetone ciascuno. Riempire completamente la canna della siringa con acetone dal primo tubo. Quindi espellere l'acetone in un contenitore di rifiuti spingendo rapidamente verso il basso sullo stantuffo e ripetere altre quattro volte per completare un totale di cinque lavaggi di acetone dalla stessa aliquota di acetone.Quindi, riempire completamente il barile della siringa con aria ed espellere l'aria e i potenziali resti di acetone nel contenitore dei rifiuti. Ripeti altre due volte per completare tre lavaggi con l'aria. Creare una sacca d'aria all'interno della canna tra lo stantuffo della siringa e la parte superiore dell'ago tirando su lo stantuffo di circa cinque millimetri nella canna.Etichettare i bicchieri di plastica con l'ID casuale per la valutazione della mortalità cieca. Utilizzando un aspiratore alimentato dall'aspirazione dall'inalazione, aspirare il numero desiderato di zanzare adulte da tre a cinque giorni. Posizionare la punta dell'aspiratore nel tubo con il cotone avvolto attorno alla punta.Espirare delicatamente e toccare l'aspiratore per trasferire le zanzare in un tubo conico. Utilizzare il cotone per collegare il tubo quando viene rimossa la punta dell'aspiratore, quindi chiudere con il coperchio. Abbattere brevemente le zanzare nei tubi mettendole per un minimo di 10 minuti a quattro gradi Celsius o seppellendole sotto il ghiaccio in un vassoio di ghiaccio.Trasferisci le zanzare abbattute nella tenda per la gestione degli insetti. Punta con attenzione le zanzare su un vassoio di plastica posto sul ghiaccio e versa circa 50 zanzare alla volta per assicurarti che ognuna tocchi il vassoio fresco sotto di esso e rimanga abbattuta. Ordina le zanzare per sesso raccogliendole delicatamente per le gambe o le ali con una pinza, seguita dal posizionamento di ogni sesso in una tazza separata e fermati quando viene raggiunto il numero desiderato.Durante lo smistamento, rimuovere eventuali zanzare che sono ferite o sono extra grandi o piccole. Per registrare il peso della tazza di zanzara, posizionare una tazza vuota con una capsula di Petri come coperchio sulla bilancia e tarare la bilancia. Versare le zanzare nel contenitore e posizionare il coperchio sopra.Posiziona il contenitore sulla bilancia e registra il peso finale, insieme al numero di zanzare. Riposizionare immediatamente la tazza di campioni sul ghiaccio per tenerli immobilizzati fino a quando tutte le tazze del campione non vengono pesate. Dividere le zanzare preparate in cinque a 10 tazze separate poste sul ghiaccio, etichettate con ID casuali.Usa una pinzetta e un contatore portatile per ottenere da 20 a 25 zanzare per tazza. Per ordinare i moscerini della frutta, anestetizzare le mosche usando anidride carbonica per sette secondi. Versare le mosche su un impacco di ghiaccio avvolto in carta da banco.Usando un pennello a punta fine, separare e contare i maschi e le femmine. Usa il pennello per raccogliere delicatamente le mosche scelte e metterle in una bottiglia pulita e vuota. Dopo aver scelto lo stesso numero di moscerini della frutta maschi e femmine, etichettare le bottiglie stock con il nome del ceppo e il totale del moscerino della frutta.Anestetizzare la bottiglia di moscerini della frutta usando l'anidride carbonica per sette secondi. Versare i moscerini della frutta sulla carta pesata e utilizzare la carta come imbuto per introdurre le mosche in una fiala tarata etichettata con un ID casuale.Dopo aver posizionato il coperchio della capsula di Petri sopra la fiala dei moscerini della frutta, posizionarlo sulla bilancia. Registrare il peso combinato e il numero di campioni sul foglio di punteggio.Posizionare immediatamente la fiala di moscerini della frutta in un vassoio di ghiaccio con il coperchio ancora in cima per evitare che le mosche fuoriescano. Caricare la siringa con la giusta concentrazione di insetticida, iniziando con la dose meno concentrata e lavorare verso la dose più concentrata con ciascun gruppo di organismi. Rovesciare i campioni su carta pesata posta in cima a un vassoio sul ghiaccio.Separare i campioni che sono vicini tra loro utilizzando un pennello pulito privo di insetticidi o un batuffolo di cotone per consentire un facile accesso a ciascun campione per il dosaggio. Usando la siringa, applicare una goccia di soluzione insetticida sul torace ventrale e sull'area dell'addome per le zanzare e il dorso per i moscerini della frutta. Versare immediatamente i campioni nel bicchiere di plastica etichettato.Coprire la tazza con una rete e un elastico. Nota un conteggio aggiornato del campione sulla tazza se alcuni esemplari sono stati uccisi, danneggiati o fuggiti in questo processo. Posizionare la tazza completata in un vassoio di contenimento.Per la prima tazza, registrare il tempo in cui il dosaggio è completato. Ripetere il dosaggio per ogni tazza fino a quando tutti i campioni sono stati dosati con le concentrazioni di insetticida appropriate e registrare il tempo finale in cui tutti i campioni sono stati dosati. Fornire una soluzione di saccarosio al 10% a ogni tazza tramite un batuffolo di cotone bagnato e conservare le zanzare e i moscerini della frutta alla temperatura e all'umidità desiderate.Registrare la mortalità del campione a 24 ore dopo l'inizio dell'esposizione agli insetticidi. Classificare le zanzare come vive se possono volare e tenersi in posizione eretta e morta se sono immobili o atassiche, come descritto dall'OMS. Seguire la stessa valutazione della mortalità per i moscerini della frutta.Dopo aver eseguito il biotest, sono stati ottenuti dati dose-risposta con due ceppi che sono il genotipo Rockefeller e IICC per il maschio e la femmina Aedes aegypti. La dose letale mediana relativizzata di massa per Rockefeller e IICC era rispettivamente di 0,008 e 0,336 nanogrammi per milligrammo. I risultati non hanno rivelato differenze tra le curve di risposta alla dose delle zanzare femmine e maschi all'interno di ciascun ceppo.Pertanto, i dati di entrambi i sessi sono stati combinati per calcolare i valori mediani della dose letale. Poiché gli intervalli di confidenza del 95% per la dose letale mediana di questi due ceppi non si sovrapponevano, questi valori sono stati considerati significativamente diversi. Inoltre, nel calcolare i rapporti di resistenza, il ceppo IICC era oltre 40 volte più resistente del ceppo Rockefeller suscettibile.Sono stati ottenuti anche i dati di risposta alla dose per il moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, ceppo Canton-S, e la dose letale mediana relativizzata di massa è risultata essere di 0,213 nanogrammi per milligrammo. La coerenza è fondamentale, specialmente quando si conserva e si applica l'insetticida e si valuta la mortalità. Inoltre, fare attenzione quando si maneggia il campione per evitare danni o morte non indotti dall'insetticida.Con questo metodo, ora possiamo determinare con precisione la resistenza tecnica di una popolazione di zanzare e come le condizioni ambientali influiscono sulla resistenza o come la resistenza tecnica predice la resistenza pratica.