이 연구는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)이 SH에 수여 한 CAREER Award에 의해 수상 번호 2047572로 지원되었습니다. 우리는 초파리 사육 및 국소 적용 분석 준비에 도움을 준 Damien Rivera, 광저우 - S 초파리 균주를 공유 한 위스콘신 - 매디슨 대학의 Ganetzky 박사, 록펠러 균주를 공유하기위한 질병 통제 및 예방 센터, IICC 이소린 균주를 공유하기위한 미국 농무부 의료 농업 및 수의학 곤충학 센터에 감사드립니다. 그림 1은 BioRender.com 로 작성되었습니다.

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

모기는 인간에게 전염되는 질병으로 인해 매년 700,000 명이 넘는 사망자를 초래하며, 그 중 절반 이상이 말라리아만으로 인한 사망자1입니다. 말라리아 및 기타 벡터 매개 질병의 전염에 대한 주요 예방 방법은 종종 오래 지속되는 살충제 그물 또는 실내 잔류 살포의 형태로 살충제를 사용하는 것입니다2. 그러나 살충제 내성은 모기 및 기타 곤충 벡터뿐만 아니라 농업 해충 3,4 사이에서 널리 퍼져 있습니다. 저항을 효과적으로 관리하려면 감시가 매우 중요합니다5. 이를 위해서는 매우 정확하고 높은 처리량의 저항 감지 방법이 필요합니다. 현재 모기에 대한 가장 널리 퍼져있는 살충제 내성 감시 도구는 WHO 튜브 테스트6 및 CDC 병 생물 분석7입니다. 초파리의 경우 잔류 접촉 적용 방법 (CDC 병 생물 분석과 유사)은 일반적으로 사용되는 살충제 생물 분석 8,9,10입니다. 그러나 이러한 방법으로부터의 데이터의 변동성은 일반적으로 높으며, 동일한 실험실 모기 균주의 측정은 CDC 병 분석에서 ~ 20-70 %의 사망률과 치명적인 복용량에 노출 될 때 WHO 튜브 테스트에서 0-50 %(11)에 이릅니다. 이러한 변이는 대부분의 실험실 균주에서 제한된 유전적 변이가 집단에서 제한된 살충제 감수성 변이를 초래할 것으로 예상되기 때문에 놀랍다. 그럼에도 불구하고, 생물검정 결과에서 관찰된 높은 수준의 변이가 여전히 존재한다.
이러한 변이의 잠재적 원인은 표면을 통한 간접적 인 살충제 노출, 이질적인 환경 영향, 동일한 유전자형을 가진 개인 간의 정상적인 생물학적 변이, 동일한 집단의 표본 질량의 변화로 인한 생물 분석 내 표본 간의 이질적인 살충제 노출의 결과 일 수 있습니다12 . 더 높은 재현성을 가진 드물게 사용되는 방법은 국소 적용 생물 검정입니다. 이 분석에서, 살충제는 각 곤충13,14에 직접 적용되어, 동일한 검정 내에서 상이한 표본의 이종 노출의 인자를 제거한다. 그러나이 방법의 느린 처리량 특성으로 인해 모기 개체군을위한 살충제 감수성 감시 도구로 일상적으로 사용되지 않습니다. 이 논문은 살충제 감수성의 변화와 상관 관계가 있는 파라미터인 곤충 질량의 변화를 교정하는 동시에 더 높은 처리량 노출을 허용하는 국소 적용 생물검정을 위한 변형된 프로토콜을 제시한다(12). 가변 살충제 노출로 인한 사망률 데이터의 소음 및 질량 관련 변동의 감소는 보다 정확한 기술적 저항 감시(Technical resistance surveillance 11,15)를 가능하게 할 것이다. 이러한 데이터는 표현형 내성을 유전자 마커, 적합성 파라미터 및/또는 벡터 능력과 보다 정확하게 연관시키는데 사용될 수 있다. 또한, 우리는이 분석이 더 작은 몸매의 곤충 종 인 초파리에 국소 적용 생물 분석을 사용하여 다른 곤충 종에 쉽게 적응할 수있는 방법을 보여줍니다.
전술한 잔류 접촉 용도의 주요 한계는 살충제 노출이 동일한 검정 내에서 시편마다 다를 수 있다는 것입니다. CDC 병 생물 검정 및 접촉 방법의 경우, 살충제 노출은 동일한 분석의 반복실험에 따라 다를 수 있습니다. 곤충은 유리 병 내부 (CDC 병 생물 분석 및 접촉 방법) 또는 함침 된 종이 (WHO 튜브 테스트)에 분포하는 살충제에 노출됩니다. 양쪽 표면 (유리 및 종이)에 살충제의 농도는 알려진 유전자형의 다른 종을 스크리닝함으로써 알려지고 미리 결정됩니다. 그러나, 곤충에 의해 잠재적으로 흡수될 수 있는 양은 사용되는 표면, 살충제 혼합물 성분, 및 살충제가 표면 물질(16,17)에 걸쳐 얼마나 균질하게 분포되는지에 따라 크게 변할 수 있다. CDC 병 생물 분석에서 병 내부의 살충제 코팅은 각 실험실 및 사용자가 사용하는 절차에 따라 다릅니다. WHO 튜브 테스트에서 살충제 처리 된 논문은 중앙에서 생산되므로 실험실 전체에서 매우 균질 할 가능성이 큽니다. 그러나 WHO 튜브 테스트에서 노출 튜브는 시편이 살충제에 노출되지 않은 금속 메쉬에 착륙하고 휴식을 취할 수있게하여 각 테스트 내에서 표본 중 잠재적 인 이종 살충제 노출을 유도합니다. 각 방법을 통해 표본에 의해 포착되고 흡수 된 살충제의 실제 양은 여전히 더 탐구 될 필요가 있습니다18.
추가적으로, CDC 병 생물 분석, WHO 튜브 테스트 및 접촉 방법은 하나의 미리 결정된 살충제 농도만을 시험하는 역치 분석으로 가장 일반적으로 사용된다. 이 접근법은 저항의 존재를 정확하게 감지 할 수 있으며 저항 감시 (특히 저항이 확산되는 경우)에 유용합니다. 그러나 역치 분석은 저항의 강도를 정량화 할 수 없으므로 개입 도구의 효능을 더 잘 예측할 수 있습니다. 이러한 방법과 함께 여러 살충제 농도를 사용하면 강도 분석으로 사용할 수 있습니다. CDC 병 생물 검정 및 WHO 튜브 시험에 대한 강도 검정은 감시 6,19에서 이러한 격차를 해결하기 위해 미리 결정된 판별 투여량을 5x 및 10배로 시험함으로써 도입되었다. 내성 집단을 구별하는 더 큰 능력을 제공하면서, 3-5 (미리 결정된) 복용량은 치사 농도를 계산하기 위해 제한된 해상도를 제공합니다. 또한, 다양한 크기의 모기가 이러한 분석에 사용됩니다. 그러나, 질량은 질량 단위당 유효 투여량이 더 작은 유기체(12)의 그것보다 훨씬 낮을 것이기 때문에 더 큰 표본이 더 높은 투여량이 사멸될 필요가 있을 수 있기 때문에 측정하는데 중요하다. 질량 상대화된 치사량(곤충 질량 당 살충제의 양)을 계산하는 것은 성별, 개체군 및 유전자형 사이의 곤충 질량의 변화를 고려하기 때문에 더 일반적인 치사농도(예를 들어, 표면적 당 살충제의 양)보다 더 유용한 지표가 될 것이다. 이러한 데이터는 실험실과 현장 내에서 유전자형과 표현형 내성 사이의 격차를 메우는 데 도움이되며 알려진 평균 질량의 곤충 개체군을 치료하는 데 필요한 적용 농도를 계산하는 쉬운 방법을 제공 할 수 있습니다.
표본의 50 % (LD 50)를 죽이는 대량 상대화 된 치명적인 복용량의 사용은 또한 몇 가지 다른 이점을 통합합니다. mg / kg (= ng / mg)의 특정 화합물의 독성 평가는 인간 및 수의학 독성학14에서 표준이며 LD50 값은 재료 안전 데이터 시트에서 발견됩니다. 치사량은 또한 특정 종에 대한 상이한 화학물질 또는 상이한 종(20)에 대한 동일한 화학물질 사이의 독성의 직접적인 비교뿐만 아니라, 새로운 살충제 및 화학물질(13)에 대한 고품질 평가를 허용한다. 추가적으로,LD50 은 진단 용량 사망률 결과로부터 유래된 것들보다 더 의미 있고 정확한 저항 비율을 제공할 수 있으며, 이는 집단에 존재하는 저항 수준의 과대 평가를 초래할 수 있다. 따라서, 이러한 분석은 다른 생물분석법(21)에 권장되는 것보다 더 많은 표본으로부터 유래된 질량-상대화된 치사량에 기초한 보다 엄격한 저항 모니터링을 제공함으로써 일상적인 감시 프로그램에 적합할 것이다.
국소 적용 방법은 내성이 이미 알려져 있거나 의심되는 경우 표준 살충제 감수성 생물 검정 (22,23)의 대안으로 모기 및 파리에 대한 살충제 감수성 감시뿐만 아니라 일부 해충 곤충(24)에서의 감시를 위해 내성 프로파일 및 살충제 고유 독성21을 보다 정확하게 평가하기 위해 사용되어 왔다. . 국소 적용 생물 분석에서 살충제는 각 유기체에 적용되어 살충제 노출의 변동을 최소화합니다. 이 논문은 곤충 질량22을 통제하면서 단기간에 많은 수의 곤충에 살충제 노출을 적용 할 수있게 해주는 약간 적응되고 개선 된 방법을 제시합니다. 재현성이 좋은 이 높은 처리량 방법은 일상적인 살충제 감수성 감시에 유용한 추가 도구가 될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>20A00L068</td>
			<td>Acetone aliquot storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL screw cap tubes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1182K23</td>
			<td>Insecticide dilution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>339651</td>
			<td>Insecticide dilution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0334125D</td>
			<td>Fruit fly weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 &#956;L syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14815288</td>
			<td>Topical applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423240040</td>
			<td>ACS 99.6%, 4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti (IICC strain)</td>
			<td>USDA CMAVE</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide resistant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti (Rockefeller strain)</td>
			<td>CDC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide susceptible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-557-409</td>
			<td>Precision up to 0.1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>6.49986E+11</td>
			<td>Mosquito collection device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89126-794</td>
			<td>Place under workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B092S8JVQN</td>
			<td>Use for sorting insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool balls</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B0769MKZWT</td>
			<td>Use for sucrose solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispenser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1482225</td>
			<td>Repeater pipettor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster (Canton-S strain)</td>
			<td>University of Wisconsin-Madison</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide susceptible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped paint brushes</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07KT2X1BK</td>
			<td>Use for sorting insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fruit fly stock bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS355</td>
			<td>Use for rearing and sorting fruit flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-held CO2 dispenser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1710679</td>
			<td>Use for knocking down insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding cups</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08DXG7V1S</td>
			<td>Clear plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice pack</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08QDWMMW5</td>
			<td>Use for knocking down fruit flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice trays</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>9301085269</td>
			<td>Use for knocking down insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect forceps</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07B4767WR</td>
			<td>Insect forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insecticide</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc</td>
			<td>45423-250MG</td>
			<td>Deltamethrin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling stickers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07Q4X9GWX</td>
			<td>3/4&#34; Color dot stickers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00X6A1GYK</td>
			<td>White tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netting</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07F2PHHWV</td>
			<td>Use for covering holding cups and insect handling tent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712H371</td>
			<td>100 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC Pipe</td>
			<td>Lowe&#8217;s</td>
			<td>23971</td>
			<td>Insect handling tent materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00006IBRU</td>
			<td>Use for securing mesh/net on cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01J78INO0</td>
			<td>Granulated White Sugar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12578-165</td>
			<td>4&#34; x 4&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

topical application bioassay to quantify insecticide toxicity for mosquitoes and fruit flies

공중 보건 및 농업을위한 살충제의 지속적인 사용은 광범위한 살충제 내성과 통제 방법의 방해로 이어졌습니다. 모기 개체군에 대한 살충제 내성 감시는 일반적으로 질병 통제 예방 센터 (CDC) 병 생물 분석 또는 세계 보건기구 (WHO) 튜브 테스트를 통해 수행됩니다. 그러나 이러한 방법은 곤충과의 가변 살충제 접촉, 테스트 된 비교적 적은 수의 유기체, 인구 간 질량의 광범위한 변화 및 끊임없이 변화하는 환경 조건으로 인해 사망률 데이터의 높은 수준의 변동성을 초래할 수 있으며 다양한 결과를 초래할 수 있습니다. 이 논문은 모기와 초파리 모두에 대한 고처리량 표현형 생물 분석법으로 채택 된 국소 응용 생물 분석을 제시하여 다양한 살충제 농도에 따라 많은 수의 곤충을 테스트합니다.
이 분석은 1) 모든 유기체와의 일관된 치료 및 살충제 접촉을 보장하고, 2) 균주와 성별 간의 평균 질량의 차이를 설명하는 매우 구체적인 용량 - 반응 곡선을 생성하며(이는 현장 수집 생물에 특히 중요함), 3) 통계적으로 엄격한 중간 치사량 (LD50 ), 저항 비율 비교에 필요한 - 유충 내성 감시에도 사용되는 진단 용량 사망률로부터의 대안적인 감시 접근법. 이 분석은 모기 개체군을 정확하게 표현하기위한 보완적인 도구가 될 것이며, 초파리를 사용하여 예시 된 바와 같이 다른 곤충과 함께 사용하기 위해 쉽게 적응할 수 있습니다. 우리는이 분석이 여러 곤충 종에서 유전자형과 표현형 살충제 내성 사이의 격차를 메우는 데 도움이 될 것이라고 주장합니다.

이러한 대표적인 결과는 Ae. aegypti, Rockefeller (ROCK) 및 플로리다로부터의 분리된 필드 균주의 두 가지 상이한 균주를 특징으로 하며, 알려진 녹다운 내성 돌연변이 F1534C 및 V1016I (IICC 유전자형)를 갖는다. 또한, 초파리 멜라노가스터 (광저우 : S 균주)가 특징입니다.
도 2 및 도 3은 상기 프로토콜에 따라 시험된 균주 및 성별에 의한 각 유기체의 용량 반응을 도시한다. 각 균주 내의 수컷 및 암컷 모기의 용량-반응 곡선 사이에 차이가 관찰되지 않았기 때문에(ROCK의 경우 t=1.70, p=0.098 및 IICC의 경우 t=0.64, p=0.527), 각 모기 균주 내의 남녀 모두로부터의 데이터가 풀링되었다. ROCK 및 IICC에 대한 질량 상대화 LD50은 각각 0.008 ng / mg (95 % CI : 0-0.104) 및 0.336 ng / mg (95 % CI : 0.235-0.438)입니다. 이들 값의 95% CI는 겹치지 않으며, 이는 균주의 유의하게 상이한 용량 반응을 나타낸다. IICC 균주의 RR (ROCK 균주에 비해)은 41.7이며, 이는 WHO에 따르면 매우 내성이 높은 것으로 간주됩니다5. 광저우 - S 초파리의 경우, 질량 상대화 된 LD 50은 0.213 ng / mg (95 % CI :0-0.490)입니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig02.jpg"> 도 2: 국소 적용 생물검정을 이용한 모기의 대표적인 데이터. 델타메트린 및 모기를 이용한 상기 프로토콜에 따른 국소 적용 생물검정으로부터의 대표적인 용량-반응 데이터: (A) 암컷 Aegypti ROCK (n=880) 및 IICC (n=550) 균주, (B) 수컷 Aegypti ROCK (n=880) 및 IICC (n=569) 균주. 델타 메스 린 테스트 농도는 0.00075 ng / μL에서 9.68705 ng / μL까지 다양했으며 평균 모기 질량 (mg) 당 적용된 델타 메스 린 (ng)의 용량은 x 축에 반영됩니다. 사망률은 y축의 비율로 표시됩니다. 각 데이터 포인트 클러스터를 통과하는 검은 선은 변형률 및 성별별 선형 회귀를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig03.jpg"> 그림 3: 국소 적용 생물검정을 이용한 초파리의 대표적인 데이터. 델타메트린 및 초파리를 이용한 상기 프로토콜에 따른 국소 적용 생물분석으로부터의 대표적인 용량-반응 데이터: D. melanogaster Canton-S 균주 (n=1014). 델타 메스 린 시험 농도는 0.00499 ~ 5.02876 ng / μL의 범위였으며 평균 초파리 질량 (mg) 당 적용된 델타 메스 린 (ng)의 용량은 x 축에 반영됩니다. 사망률은 y축의 비율로 표시됩니다. 검은색 선은 선형 회귀를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S1 : 벤치 탑 곤충 취급 텐트. 벤치 탑 곤충 취급 텐트는 국소 적용 분석 중에 모기 또는 파리를 탈출하는 것을 쉽게 포획하는 데 사용됩니다. 구조는 A 에서 닫히고 B에서 열립니다. 이 구조는 PVC 파이프와 미세 메쉬 직물로 지어졌습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure1.Final.V1.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S2: 주사기 및 리피터 어플리케이터 장치. 곤충 투약에 사용되는 주사기 및 중계기 어플리케이터 장치. 주요 부품에는 1) 바늘, 2) 주사기 배럴, 3) 플런저, 4) 리피터 및 5) 리피터 버튼이 포함됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure2.Final.V1.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1 : 무작위 화 스크립트 : 무작위화 스크립트는 각 실험의 모든 컵에 대해 편향되지 않은 레이블을 만듭니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File1_Randomization.Script.Final.V1.docx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 2 : 사망률 점수 시트 : 사망률 평가를 돕기 위한 사망률 점수 시트. 시트에는 살충제 적용 시작 및 종료 시간과 같이 프로토콜에서 참조되는 다른 모든 중요한 정보를 기록 할 수있는 장소도 포함되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File2_Mortality.Score.Sheet.Final.V1%20(1).docx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 3 : 사망률 데이터 예 : 그림 2를 만드는 데 사용되는 예제 데이터 파일. 열 제목 설명은 다음과 같습니다: "id" = 각 데이터 포인트의 식별 코드; "종" = 종 이름 (예를 들어, 에데스 애석티); "살충제"= 국소적으로 적용되는 살충제의 이름 (예를 들어, 델타 메트린); "균주" = 모기 균주의 명칭 (예를 들어, ROCK); "날짜"= 시작 날짜 국소 응용 프로그램; "섹스"= 모기의 성별; "나이"= 모기의 나이 (젊은 = 3-5 일, 나이 = 4 주); "total.mosq"= 배치로 무게가 나가는 모기의 총 수; "무게"= 배치 내의 모든 모기의 무게 (mg); "농도"= 살충제의 농도 (μg / mL); "주사기" = 주사기의 액적 부피(mL); "용량" = 각 모기에 적용되는 살충제 활성 성분의 양(ng); "전체"= 각 컵에있는 모기의 수; "죽은"= 각 컵에있는 죽은 모기의 수. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File3_Example.Data.Final.V1%20(1).txt" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 4 : R 분석 코드 : Probit 분석을 완료하는 데 사용할 수 있는 예제 R 코드(프로토콜의 단계 8에 설명된 대로). 대표적인 결과(보충 예제 데이터 파일을 통해 액세스할 수 있음)를 이 R 코드와 함께 사용할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File4.Final.V3%20(1).R" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies at JoVE.com

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

우리는 모기와 초파리에서 살충제 감수성을 측정하기위한 국소 적용 생물 분석의 방법론과 중요성을 설명합니다. 제시된 분석은 높은 처리량이며, 곤충 질량을 이용한다 - 따라서 농도 대신에 질량-상대화된 치사량을 계산할 수 있게 한다-그리고 다른 유사한 방법들보다 더 낮은 가변성을 가질 가능성이 있다.

모기 및 초파리에 대한 살충제 독성을 정량화하기위한 국소 응용 생물 검정

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

표면 접촉보다는 곤충에 살충제를 직접 적용함으로써 살충제 노출의 변동을 최소화 할 수 있으며 이를 통해 모기 개체군의 감수성 프로파일을보다 정확하게 측정 할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 치명적인 농도보다는 살충제의 질량 상대화 된 치사 용량을 계산할 수있게하여 저항 비율 비교를 크게 향상시킬 수 있다는 것입니다. 살충제를 올바르게 보관하고, 도구를 오염시키지 않으며, 주사기 부품의 상태가 양호한지 확인하십시오.이렇게하면 일관된 결과를 얻는 데 도움이됩니다. 시작하려면 냉동실에서 필요한 살충제 용액을 제거하십시오. 즉시 용액을 와류하거나 다섯 번 뒤집어 놓고 실온에서 내광성 용기에 넣어 살충제를 실온으로 따뜻하게하십시오.각각 0.5 밀리리터의 아세톤을 가진 5개의 마이크로 원심분리 튜브를 세팅한다. 주사기 배럴을 첫 번째 튜브의 아세톤으로 완전히 채 웁니다. 그런 다음 플런저를 신속하게 밀어 아세톤을 폐기물 용기에 넣고 네 번 더 반복하여 동일한 아세톤 분취액에서 총 다섯 개의 아세톤 세척을 완료하십시오.그런 다음 주사기 배럴을 공기로 완전히 채우고 공기 및 잠재적 인 아세톤 잔해를 폐기물 용기로 배출하십시오. 공기로 세 번 세척을 완료하려면 두 번 더 반복하십시오. 주사기 플런저와 바늘 상단 사이의 배럴 내에 플런저를 배럴 안으로 약 다섯 밀리미터 정도 당겨 공기 주머니를 만듭니다.블라인드 사망률 평가를 위해 플라스틱 보관 컵에 임의의 ID로 라벨을 붙입니다. 흡입 흡입으로 구동되는 흡인기기를 사용하여 원하는 수의 삼 ~ 다섯 일 된 성인 모기를 흡인하십시오. 흡입기의 끝을 면으로 감싸 튜브에 넣으십시오.부드럽게 내쉬고 흡인물을 두드려 모기를 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 흡입기 팁이 제거될 때 면을 사용하여 튜브를 꽂은 다음 뚜껑을 덮으십시오. 튜브에있는 모기를 섭씨 4도에서 최소 10 분 동안 두거나 얼음 쟁반의 얼음 아래에 묻어 간단히 쓰러 뜨립니다.쓰러진 모기를 곤충 취급 텐트로 옮기십시오. 조심스럽게 모기를 얼음 위에 놓인 플라스틱 쟁반에 밀어 넣고 한 번에 약 50 마리의 모기를 부어 각 모기가 그 아래의 시원한 쟁반에 닿고 쓰러진 상태를 유지하도록하십시오. 모기를 포셉으로 다리 나 날개로 부드럽게 집어 들고 각 성별을 별도의 홀딩 컵에 넣고 원하는 수에 도달하면 멈추십시오.분류하는 동안 부상을 입었거나 매우 크거나 작은 모기를 제거하십시오. 모기 컵의 무게를 기록하려면 페트리 접시가있는 빈 컵을 저울의 뚜껑으로 놓고 저울을 깎으십시오. 모기를 용기에 붓고 뚜껑을 위에 놓습니다.컨테이너를 저울에 놓고 모기의 수와 함께 최종 무게를 기록하십시오. 즉시 표본 컵을 얼음 위에 다시 올려 놓고 표본의 모든 컵을 칭량할 때까지 고정시킵니다. 준비된 모기를 얼음 위에 놓인 다섯 개에서 10 개의 분리 된 컵으로 나누고 임의의 ID로 표시하십시오.핀셋과 핸드 헬드 카운터를 사용하여 컵 당 20 ~ 25 마리의 모기를 얻으십시오. 초파리를 분류하려면 일곱 초 동안 이산화탄소를 사용하여 파리를 마취하십시오. 파리를 벤치 종이에 싸인 얼음 팩에 붓습니다.미세한 페인트 브러시를 사용하여 남성과 여성을 분리하고 계산하십시오. 페인트 브러시를 사용하여 선택한 파리를 부드럽게 집어 들고 깨끗하고 빈 재고 병에 넣으십시오. 동일한 수의 수컷 및 여성 초파리를 선택한 후 스톡 병에 스트레인 이름과 과일 파리 합계로 라벨을 붙입니다.일곱 초 동안 이산화탄소를 사용하여 초파리의 병을 마취하십시오. 초파리를 계량 용지에 붓고 종이를 깔때기로 사용하여 파리를 임의의 ID로 표시된 타르 드 바이알에 넣습니다.초파리의 바이알 위에 페트리 접시 뚜껑을 놓은 후 저울에 놓습니다. 점수 시트에 표본의 결합 된 무게와 수를 기록하십시오.파리가 탈출하는 것을 막기 위해 뚜껑을 여전히 위에 올려 놓은 얼음 쟁반에 초파리의 약병을 즉시 두십시오. 주사기에 적절한 살충제 농도를로드하고, 최소 농축 용량으로 시작하여 각 유기체 그룹과 함께 가장 집중된 용량으로 작업하십시오. 시편을 얼음 위의 트레이 위에 놓인 계량 용지에 팁으로 씌우십시오.깨끗한 살충제가없는 페인트 브러시 또는 면봉을 사용하여 서로 가까운 표본을 분리하여 투약을 위해 각 표본에 쉽게 접근 할 수 있도록하십시오. 주사기를 사용하여 모기의 경우 복부 흉부 및 복부 부위에 살충제 용액 한 방울을 바르고 초파리의 경우 도섬을 바르십시오. 즉시 시편을 라벨이 붙은 플라스틱 컵에 다시 붓습니다.컵을 그물망과 고무 밴드로 덮으십시오. 이 과정에서 어떤 표본이 죽거나 손상되거나 탈출 된 경우 컵에 업데이트 된 표본 수를 기록하십시오. 완성 된 컵을 홀딩 트레이에 넣으십시오.첫 번째 컵의 경우, 투약이 완료된 시간을 기록하십시오. 모든 표본이 적절한 살충제 농도로 투여 될 때까지 각 컵에 대해 투약을 반복하고 모든 표본이 투여 된 종료 시간을 기록하십시오. 젖은 면봉을 통해 각 컵에 10 % 자당 용액을 제공하고 모기와 초파리를 원하는 온도와 습도로 보관하십시오.살충제 노출 시작 후 24 시간에 표본 사망률을 기록하십시오. WHO가 묘사 한 바와 같이 모기가 움직이지 않거나 운동 실조적 인 경우 모기가 날아 다니고 똑바로 서서 죽을 수 있다면 살아있는 것으로 분류하십시오. 초파리에 대해 동일한 사망률 평가를 따르십시오.생물검정을 수행한 후, 용량 반응 데이터는 남성 및 여성 Aedes aegypti에 대한 록펠러 및 IICC 유전자형인 두 균주를 특징으로 하는 수득되었다. 록펠러 및 IICC에 대한 질량 상대화된 중앙값 치사량은 밀리그램 당 각각 0.008 및 0.336 나노그램이었다. 결과는 각 균주 내에서 암컷과 수컷 모기의 용량 반응 곡선 사이에 차이가 없음을 밝혀 냈습니다.따라서 남녀 모두로부터의 데이터를 결합하여 중앙값 치사량 값을 계산하였다. 이 두 균주의 중간 치사량에 대한 95%신뢰구간이 겹치지 않았기 때문에, 이들 값은 유의하게 상이한 것으로 간주되었다. 추가적으로, 내성 비율을 계산할 때, IICC 균주는 감수성 록펠러 균주보다 40배 이상 내성이 더 높았다.초파리, 초파리 멜라노가스터, 광저우-S 균주에 대한 용량 반응 데이터도 얻어졌으며, 질량 상대화된 중앙값 치사량은 밀리그램 당 0.213 나노그램인 것으로 밝혀졌다. 일관성은 특히 살충제를 저장 및 적용하고 사망률을 평가할 때 중요합니다. 또한 살충제에 의해 유발되지 않은 해로움이나 사망을 피하기 위해 표본을 취급 할 때주의하십시오.이 방법을 통해 우리는 이제 모기 개체군의 기술적 저항과 환경 조건이 저항에 미치는 영향 또는 기술적 저항이 실제 저항을 예측하는 방법을 정확하게 결정할 수 있습니다.