Esta investigación fue apoyada por un premio CAREER de la Fundación Nacional de Ciencias a SH bajo el premio número 2047572. Agradecemos a Damien Rivera por su asistencia en la cría de moscas de la fruta y la preparación para el ensayo de aplicación tópica, al Dr. Ganetzky de la Universidad de Wisconsin-Madison por compartir su cepa de mosca de la fruta Canton-S, a los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades por compartir la cepa Rockefeller y al Centro de Entomología Médica Agrícola y Veterinaria del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos por compartir la cepa isolina IICC. La Figura 1 se creó con BioRender.com.

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Los mosquitos son responsables de más de 700,000 muertes cada año debido a las enfermedades que transmiten a los humanos, y más de la mitad de esas muertes se deben solo a la malaria1. El principal método preventivo contra la transmisión del paludismo y otras enfermedades transmitidas por vectores es el uso de insecticidas, a menudo en forma de mosquiteros de larga duración o fumigación residual en interiores2. Sin embargo, la resistencia a los insecticidas está muy extendida entre los mosquitos y otros insectos vectores, así comoentre las plagas agrícolas 3,4. Para gestionar eficazmente la resistencia, la vigilancia es de vital importancia5. Para esto, se necesitan métodos de detección de resistencia altamente precisos y de alto rendimiento. Actualmente, las herramientas de vigilancia de la resistencia a los insecticidas más extendidas para los mosquitos son la pruebade tubo 6 de la OMS y el bioensayode botella 7 de los CDC. Para las moscas de la fruta, el método de aplicación de contacto residual (similar al bioensayo de botella de los CDC) es un bioensayo insecticida de uso común 8,9,10. Sin embargo, la variabilidad en los datos de estos métodos suele ser alta, con mediciones de la misma cepa de mosquito de laboratorio que oscilan entre ~ 20-70% de mortalidad en los ensayos de botellas de los CDC y 0-50% en las pruebas de tubo de la OMS cuando se exponen a dosis subletales11. Tal variación es sorprendente porque se espera que la variación genética limitada en la mayoría de las cepas de laboratorio conduzca a una variación limitada de la susceptibilidad a los insecticidas en la población. Sin embargo, todavía hay un alto nivel de variación observado en los resultados del bioensayo.
Las fuentes potenciales de esta variación podrían ser el resultado de la exposición heterogénea a insecticidas entre especímenes dentro del bioensayo debido a la exposición indirecta a insecticidas a través de la superficie, efectos ambientales heterogéneos, variación biológica normal entre individuos del mismo genotipo y variación en la masa de especímenes de la misma población12 . Un método poco utilizado con mayor replicabilidad es el bioensayo de aplicación tópica. En este ensayo, el insecticida se aplica directamente a cada insecto 13,14, eliminando el factor de exposición heterogénea de diferentes ejemplares dentro de un mismo ensayo. Sin embargo, debido a la naturaleza de rendimiento lento de este método, no se utiliza rutinariamente como una herramienta de vigilancia de la susceptibilidad a los insecticidas para las poblaciones de mosquitos. Este artículo presenta un protocolo modificado para el bioensayo de aplicación tópica que permite exposiciones de mayor rendimiento al tiempo que corrige la variación en la masa de insectos, un parámetro que se correlaciona con los cambios en la susceptibilidad a los insecticidas12. Una reducción en el ruido y la variación asociada a la masa en los datos de mortalidad por exposición variable a insecticidas permitiría una vigilancia técnica de la resistencia más precisa11,15. Dichos datos podrían utilizarse para asociar con mayor precisión la resistencia fenotípica con marcadores genéticos, parámetros de aptitud y/o competencia vectorial. Además, demostramos cómo este ensayo podría adaptarse fácilmente a otras especies de insectos mediante el uso del bioensayo de aplicación tópica en moscas de la fruta, una especie de insecto de cuerpo más pequeño.
La principal limitación de las aplicaciones de contacto residual antes mencionadas es que la exposición a insecticidas puede variar de un espécimen a otro dentro del mismo ensayo. En el caso de los bioensayos de botellas de los CDC y el método de contacto, la exposición a insecticidas puede variar entre réplicas del mismo ensayo. Los insectos están expuestos a insecticidas que se distribuyen en el interior de una botella de vidrio (método de contacto y bioensayo de botellas de los CDC) o en papeles impregnados (prueba de tubo de la OMS). La concentración de insecticida en ambas superficies (vidrio y papel) es conocida y predeterminada mediante el cribado de diferentes especies de genotipos conocidos. Sin embargo, la cantidad disponible para ser potencialmente absorbida por el insecto puede variar mucho dependiendo de la superficie utilizada, los componentes de la mezcla de insecticidas y la homogeneidad con la que el insecticida se distribuye a través del material de la superficie16,17. En el bioensayo de la botella de los CDC, el recubrimiento insecticida en el interior de la botella depende de los procedimientos empleados por cada laboratorio y usuario. En la prueba de tubo de la OMS, los papeles tratados con insecticida se producen centralmente y, por lo tanto, lo más probable es que sean bastante homogéneos en todos los laboratorios. Sin embargo, en la prueba de tubo de la OMS, el tubo de exposición permite que las muestras aterricen y descansen sobre una malla metálica no expuesta a insecticidas, lo que lleva a una posible exposición heterogénea a insecticidas entre las muestras dentro de cada prueba. La cantidad real de insecticida recogido y absorbido por los especímenes a través de cada método aún debe explorarse mása fondo 18.
Además, el bioensayo de botellas de los CDC, la prueba de tubo de la OMS y el método de contacto se utilizan con mayor frecuencia como ensayos de umbral que prueban solo una concentración predeterminada de insecticida. Este enfoque puede detectar con precisión la presencia de resistencia y es valioso para la vigilancia de la resistencia (especialmente cuando la resistencia se está extendiendo). Sin embargo, los ensayos de umbral no pueden cuantificar la fuerza de la resistencia, lo que podría ser más predictivo de la eficacia de las herramientas de intervención. Si se utilizan múltiples concentraciones de insecticidas con estos métodos, entonces se pueden usar como ensayos de intensidad. Los ensayos de intensidad para el bioensayo de botellas de los CDC y la prueba de tubo de la OMS se han introducido mediante la prueba de 5x y 10 veces las dosis discriminantes predeterminadas para abordar esta brecha en la vigilancia 6,19. Si bien proporciona una mayor capacidad para diferenciar entre poblaciones resistentes, 3-5 dosis (predeterminadas) proporcionan una resolución limitada para calcular las concentraciones letales. Además, los mosquitos de varios tamaños se utilizan en tales ensayos. Sin embargo, es importante medir la masa, ya que los especímenes más grandes podrían necesitar una dosis más alta para ser eliminados, ya que la dosis efectiva por unidad de masa será mucho menor que la de un organismo más pequeño12. Calcular una dosis letal relativizada en masa (cantidad de insecticida por masa de insecto) sería una métrica más útil que la concentración letal más común (por ejemplo, cantidad de insecticida por área de superficie), ya que considera la variación de la masa de insectos entre sexos, poblaciones y genotipos. Tales datos ayudarían a llenar el vacío entre la resistencia genotípica y fenotípica dentro del laboratorio y el campo y también podrían proporcionar una manera fácil de calcular la concentración de aplicación necesaria para tratar una población de insectos de una masa promedio conocida.
El uso de dosis letales relativizadas en masa que matan el 50% de los especímenes (LD50) también incorpora varios otros beneficios. La evaluación de la toxicidad de un compuesto específico en mg/kg (= ng/mg) es estándar en toxicología humana y veterinaria14, y los valores de DL50 se encuentran en las fichas de datos de seguridad de los materiales. Las dosis letales también permiten la comparación directa de la toxicidad entre diferentes productos químicos hacia una especie en particular o el mismo producto químico hacia diferentes especies20, así como la evaluación de alta calidad de nuevos insecticidas y productos químicos13. Además, la DL50 puede proporcionar proporciones de resistencia más significativas y precisas que las derivadas de los resultados de mortalidad por dosis diagnósticas, lo que puede resultar en una sobreestimación del nivel de resistencia presente en una población. Por lo tanto, este ensayo sería adecuado para los programas de vigilancia de rutina al proporcionar un monitoreo de resistencia más riguroso basado en dosis letales relativizadas en masa derivadas de más especímenes de los recomendados para otros bioensayos21.
El método de aplicación tópica se ha utilizado en la vigilancia de la susceptibilidad a insecticidas para mosquitos y moscas como alternativa para los bioensayos estándar de susceptibilidad a insecticidas cuando ya se conoce o sospecha resistencia22,23, así como para la vigilancia en algunos insectos plaga24 para evaluar con mayor precisión los perfiles de resistencia y la toxicidad intrínseca del insecticida21 . En los bioensayos de aplicación tópica, el insecticida se aplica a cada organismo, lo que resulta en una variación mínima en la exposición al insecticida. Este artículo presenta un método ligeramente adaptado y mejorado que permite aplicar la exposición a insecticidas a un gran número de insectos en un corto período de tiempo, al tiempo que controla la masa de insectos22. Este método de mayor rendimiento con buenos niveles de replicabilidad podría ser una herramienta adicional útil para la vigilancia rutinaria de la susceptibilidad a los insecticidas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>20A00L068</td>
			<td>Acetone aliquot storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL screw cap tubes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1182K23</td>
			<td>Insecticide dilution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>339651</td>
			<td>Insecticide dilution storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0334125D</td>
			<td>Fruit fly weighing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 &#956;L syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14815288</td>
			<td>Topical applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423240040</td>
			<td>ACS 99.6%, 4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti (IICC strain)</td>
			<td>USDA CMAVE</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide resistant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes aegypti (Rockefeller strain)</td>
			<td>CDC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide susceptible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical scale</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-557-409</td>
			<td>Precision up to 0.1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>6.49986E+11</td>
			<td>Mosquito collection device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bench paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89126-794</td>
			<td>Place under workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B092S8JVQN</td>
			<td>Use for sorting insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton wool balls</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B0769MKZWT</td>
			<td>Use for sucrose solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispenser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1482225</td>
			<td>Repeater pipettor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster (Canton-S strain)</td>
			<td>University of Wisconsin-Madison</td>
			<td>NA</td>
			<td>Insecticide susceptible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped paint brushes</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07KT2X1BK</td>
			<td>Use for sorting insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fruit fly stock bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS355</td>
			<td>Use for rearing and sorting fruit flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-held CO2 dispenser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1710679</td>
			<td>Use for knocking down insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding cups</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08DXG7V1S</td>
			<td>Clear plastic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice pack</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B08QDWMMW5</td>
			<td>Use for knocking down fruit flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice trays</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>9301085269</td>
			<td>Use for knocking down insects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect forceps</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07B4767WR</td>
			<td>Insect forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insecticide</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc</td>
			<td>45423-250MG</td>
			<td>Deltamethrin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling stickers</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07Q4X9GWX</td>
			<td>3/4&#34; Color dot stickers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00X6A1GYK</td>
			<td>White tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netting</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07F2PHHWV</td>
			<td>Use for covering holding cups and insect handling tent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712H371</td>
			<td>100 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVC Pipe</td>
			<td>Lowe&#8217;s</td>
			<td>23971</td>
			<td>Insect handling tent materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bands</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B00006IBRU</td>
			<td>Use for securing mesh/net on cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01J78INO0</td>
			<td>Granulated White Sugar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12578-165</td>
			<td>4&#34; x 4&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

topical application bioassay to quantify insecticide toxicity for mosquitoes and fruit flies

El uso continuado de insecticidas para la salud pública y la agricultura ha dado lugar a una resistencia generalizada a los insecticidas y ha obstaculizado los métodos de control. La vigilancia de la resistencia a los insecticidas de las poblaciones de mosquitos generalmente se realiza a través de bioensayos de botellas de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) o pruebas de tubo de la Organización Mundial de la Salud (OMS). Sin embargo, estos métodos pueden resultar en un alto grado de variabilidad en los datos de mortalidad debido al contacto variable del insecticida con el insecto, el número relativamente pequeño de organismos probados, la amplia variación en la masa entre las poblaciones y las condiciones ambientales en constante cambio, lo que lleva a resultados variables. Este artículo presenta el bioensayo de aplicación tópica, adaptado como un bioensayo fenotípico de alto rendimiento tanto para mosquitos como para moscas de la fruta, para probar un gran número de insectos a lo largo de un rango de concentraciones de insecticidas.
Este ensayo 1) asegura un tratamiento consistente y el contacto insecticida con cada organismo, 2) produce curvas dosis-respuesta altamente específicas que tienen en cuenta las diferencias en la masa promedio entre cepas y sexos (lo cual es particularmente importante para los organismos recolectados en el campo), y 3) permite el cálculo de dosis letales medianas estadísticamente rigurosas (LD50 ), que son necesarios para las comparaciones de la relación de resistencia, un enfoque de vigilancia alternativo de la mortalidad por dosis diagnósticas, que también se utiliza para la vigilancia de la resistencia a los larvicidas. Este ensayo será una herramienta complementaria para fenotipar con precisión las poblaciones de mosquitos y, como se ilustra con moscas de la fruta, es fácilmente adaptable para su uso con otros insectos. Argumentamos que este ensayo ayudará a llenar el vacío entre la resistencia a los insecticidas genotípicos y fenotípicos en múltiples especies de insectos.

Estos resultados representativos presentan dos cepas diferentes de Ae. aegypti, Rockefeller (ROCK) y una cepa de campo aislada de Florida con mutaciones conocidas de resistencia al derribo F1534C y V1016I (genotipo IICC). Además, se presenta Drosophila melanogaster (cantón: cepa S).
La Figura 2 y la Figura 3 ilustran la respuesta a la dosis de cada organismo por cepa y sexo probado siguiendo el protocolo anterior. Como no se observaron diferencias entre las curvas dosis-respuesta de los mosquitos macho y hembra dentro de cada cepa (t = 1,70, p = 0,098 para ROCK y t = 0,64, p = 0,527 para IICC), se agruparon los datos de ambos sexos dentro de cada cepa de mosquito. La DL50 relativizada en masa para ROCK e IICC es de 0,008 ng/mg (IC del 95%: 0-0,104) y 0,336 ng/mg (IC del 95%: 0,235-0,438), respectivamente. Los IC del 95% de estos valores no se superponen, lo que indica respuestas a la dosis significativamente diferentes de las cepas. El RR de la cepa IICC (en relación con la cepa ROCK) es de 41,7, que según la OMS, se considera altamente resistente5. Para las moscas de la fruta de Cantón-S, la DL50 relativizada en masa es de 0,213 ng/mg (IC del 95%: 0-0,490).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig02.jpg"> Figura 2: Datos representativos de mosquitos mediante bioensayo de aplicación tópica. Datos representativos de dosis-respuesta del bioensayo de aplicación tópica siguiendo el protocolo anterior utilizando deltametrina y mosquitos: (A) hembra Ae. aegypti ROCK (n = 880) y CEPA IICC (n = 550), (B) macho Ae. aegypti ROCK (n = 880) y IICC (n = 569) cepas. Las concentraciones de prueba de deltametrina variaron de 0,00075 ng/μL a 9,68705 ng/μL, y la dosis de deltametrina aplicada (ng) por masa media de mosquito (mg) se refleja en el eje X. La mortalidad se muestra como una proporción en el eje y. La línea negra a través de cada grupo de puntos de datos representa la tensión y la regresión lineal específica del sexo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63391/63391fig03.jpg"> Figura 3: Datos representativos de moscas de la fruta mediante bioensayo de aplicación tópica. Datos representativos de dosis-respuesta del bioensayo de aplicación tópica siguiendo el protocolo anterior utilizando deltametrina y moscas de la fruta: cepa D. melanogaster Canton-S (n = 1014). Las concentraciones de prueba de deltametrina variaron de 0,00499 a 5,02876 ng/μL, y la dosis de deltametrina aplicada (ng) por masa media de mosca de la fruta (mg) se refleja en el eje x. La mortalidad se muestra como una proporción en el eje y. La línea negra representa la regresión lineal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/63391fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura suplementaria S1: Carpa de manipulación de insectos de sobremesa. La carpa de manejo de insectos de sobremesa se utiliza para una captura más fácil de mosquitos o moscas que escapan durante el ensayo de aplicación tópica. La estructura está cerrada en A y abierta en B. Esta estructura fue construida con tubería de PVC y tela de malla fina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure1.Final.V1.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria S2: Unidad aplicadora de jeringa y repetidor. Jeringa y unidad aplicadora repetidora utilizada para la dosificación de insectos. Las partes principales incluyen 1) aguja, 2) barril de jeringa, 3) émbolo, 4) repetidor y 5) botón repetidor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_Figure2.Final.V1.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo suplementario 1: Script de aleatorización: Script de aleatorización para crear etiquetas no sesgadas para todas las tazas de cada experimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File1_Randomization.Script.Final.V1.docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Expediente suplementario 2: Hoja de puntuación de mortalidad: Hoja de puntuación de mortalidad para ayudar a la evaluación de la mortalidad. La hoja también incluye lugares para registrar toda otra información importante para registrar, como se hace referencia en el protocolo, como las horas de inicio y finalización de la aplicación de insecticidas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File2_Mortality.Score.Sheet.Final.V1%20(1).docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo suplementario 3: Ejemplo de datos de mortalidad: Archivo de datos de ejemplo utilizado para crear la figura 2. Las descripciones de los encabezados de columna son las siguientes: "id" = código de identificación de cada punto de datos; "especie" = nombre de la especie (por ejemplo, Aedes aegypti); "insecticida" = nombre del insecticida aplicado tópicamente (por ejemplo, deltametrina); "cepa" = nombre de la cepa del mosquito (por ejemplo, ROCK); "fecha" = fecha de inicio de la aplicación tópica; "sexo" = sexo de los mosquitos; "edad" = edad de los mosquitos (jóvenes = 3-5 días de edad; edad = 4 semanas de edad); "total.mosq" = número total de mosquitos pesados en lote; "peso" = peso (mg) de todos los mosquitos dentro del lote; "concentración" = concentración de insecticida (μg/mL); "jeringa" = volumen de gotas (ml) de la jeringa; "dosis" = cantidad de ingrediente activo insecticida aplicado a cada mosquito (ng); "total" = número de mosquitos en cada taza; "muerto" = número de mosquitos muertos en cada taza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File3_Example.Data.Final.V1%20(1).txt" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo suplementario 4: Código de análisis R: Ejemplo de código R que se puede utilizar para completar el análisis de Probit (como se describe en el paso 8 del protocolo). Los resultados representativos (accesibles a través del archivo de datos de ejemplo suplementario) se pueden utilizar con este código R. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63391/Supplemental_File4.Final.V3%20(1).R" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

Describimos la metodología e importancia del bioensayo de aplicación tópica para medir la susceptibilidad a insecticidas en mosquitos y moscas de la fruta. El ensayo presentado es de alto rendimiento, utiliza masa de insectos, lo que permite calcular una dosis letal relativizada en masa en lugar de concentración, y probablemente tiene una variabilidad más baja que otros métodos similares.

Bioensayo de aplicación tópica para cuantificar la toxicidad de insecticidas para mosquitos y moscas de la fruta

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

Al aplicar directamente insecticida en el insecto en lugar de a través del contacto superficial, hay una variación mínima en la exposición al insecticida, y esto nos permite medir el perfil de susceptibilidad de las poblaciones de mosquitos con mayor precisión. La principal ventaja de esta técnica es que nos permite calcular dosis letales relativizadas en masa de un insecticida en lugar de concentraciones letales, lo que mejora en gran medida las comparaciones de la relación de resistencia. Tenga cuidado de almacenar los insecticidas correctamente, evite contaminar sus herramientas y asegúrese de que las partes de la jeringa estén en buen estado.Esto le ayudará a obtener resultados consistentes. Para comenzar, retire las soluciones insecticidas necesarias del congelador. Vórtice inmediatamente la solución o invierta cinco veces, y colóquela en un recipiente resistente a la luz a temperatura ambiente para dejar que los insecticidas se calienten a temperatura ambiente antes de usarlos.Coloque cinco tubos de microcentrífuga con 0,5 mililitros de acetona cada uno. Llene el barril de la jeringa completamente con acetona del primer tubo. Luego expulse la acetona a un contenedor de desechos empujando rápidamente hacia abajo el émbolo y repita cuatro veces más para completar un total de cinco lavados de acetona de la misma alícuota de acetona.Luego, llene el barril de la jeringa completamente con aire y expulse el aire y los posibles restos de acetona en el contenedor de desechos. Repetir dos veces más para completar tres lavados con aire. Cree una bolsa de aire dentro del barril entre el émbolo de la jeringa y la parte superior de la aguja tirando del émbolo aproximadamente cinco milímetros hacia el barril.Etiquete los vasos de plástico con la identificación aleatoria para la evaluación de la mortalidad por ciegos. Usando un aspirador alimentado por succión de la inhalación, aspire el número deseado de mosquitos adultos de tres a cinco días de edad. Coloque la punta del aspirador en el tubo con algodón envuelto alrededor de la punta.Exhale suavemente y golpee el aspirador para transferir los mosquitos a un tubo cónico. Use el algodón para tapar el tubo cuando se retire la punta del aspirador y luego cúbralo con la tapa. Derribe brevemente los mosquitos en los tubos colocándolos durante un mínimo de 10 minutos a cuatro grados centígrados o enterrándolos bajo el hielo en una bandeja de hielo.Transfiera los mosquitos derribados a la tienda de manipulación de insectos. Coloque cuidadosamente los mosquitos en una bandeja de plástico colocada sobre el hielo y vierta alrededor de 50 mosquitos a la vez para asegurarse de que cada uno toque la bandeja fría debajo de ella y permanezca derribada. Clasifique los mosquitos por sexo recogiéndolos suavemente por las patas o las alas con fórceps, seguido de colocar cada sexo en una taza de sujeción separada y deténgase cuando se alcance el número deseado.Durante la clasificación, elimine los mosquitos que estén heridos o que sean extra grandes o pequeños. Para registrar el peso de la taza de mosquitos, coloque una taza vacía con una placa de Petri como tapa en la báscula y tara la báscula. Vierta los mosquitos en el recipiente y coloque la tapa encima.Coloque el recipiente en la báscula y registre el peso final, junto con el número de mosquitos. Inmediatamente coloque la taza de especímenes de nuevo sobre el hielo para mantenerlos inmovilizados hasta que se pesen todas las tazas del espécimen. Divida los mosquitos preparados en cinco a 10 tazas separadas colocadas sobre hielo, etiquetadas con identificaciones aleatorias.Use pinzas y un mostrador de mano para lograr de 20 a 25 mosquitos por taza. Para clasificar las moscas de la fruta, anestesia las moscas usando dióxido de carbono durante siete segundos. Vierta las moscas en una bolsa de hielo envuelta en papel de banco.Usando un pincel de punta fina, separe y cuente los machos y las hembras. Use el pincel para recoger suavemente las moscas elegidas y colóquelas en una botella de caldo limpia y vacía. Después de elegir el mismo número de moscas de la fruta macho y hembra, etiquete las botellas de stock con el nombre de la cepa y el total de moscas de la fruta.Anestesiar la botella de moscas de la fruta usando dióxido de carbono durante siete segundos. Vierta las moscas de la fruta sobre papel de pesaje y use el papel como un embudo para introducir las moscas en un vial empañado etiquetado con una identificación aleatoria.Después de colocar la tapa de la placa de Petri encima del vial de moscas de la fruta, colóquela en la báscula. Registre el peso combinado y el número de especímenes en la hoja de puntuación.Coloque inmediatamente el frasco de moscas de la fruta en una bandeja de hielo con la tapa todavía en la parte superior para evitar que las moscas se escapen. Cargue la jeringa con la concentración adecuada de insecticida, comenzando con la dosis menos concentrada y trabaje hacia la dosis más concentrada con cada grupo de organismos. Vierta las muestras sobre el papel de pesaje colocado sobre una bandeja sobre el hielo.Separe las muestras que están muy juntas usando un pincel limpio sin insecticida o un hisopo de algodón para permitir un fácil acceso a cada muestra para la dosificación. Con la jeringa, aplique una gota de solución insecticida en el área ventral del tórax y el abdomen para los mosquitos y el dorso para las moscas de la fruta. Vierta inmediatamente las muestras de nuevo en el vaso de plástico etiquetado.Cubra la taza con una red y una banda elástica. Tenga en cuenta un recuento de especímenes actualizado en la copa si algún espécimen fue asesinado, dañado o escapado en este proceso. Coloque la taza completa en una bandeja de sujeción.Para la primera taza, registre el tiempo en que se completa la dosificación. Repita la dosificación de cada taza hasta que todos los especímenes hayan sido dosificados con las concentraciones adecuadas de insecticida, y registre la hora de finalización cuando todos los especímenes han sido dosificados. Proporcione una solución de sacarosa al 10% a cada taza a través de una bola de algodón húmeda y almacene los mosquitos y las moscas de la fruta a la temperatura y humedad deseadas.Registre la mortalidad de los especímenes a las 24 horas después del inicio de la exposición a insecticidas. Clasificar a los mosquitos como vivos si pueden volar y mantenerse erguidos y muertos si son inmóviles o atáxicos, como lo describe la OMS. Siga la misma evaluación de mortalidad para las moscas de la fruta.Después de realizar el bioensayo, se obtuvieron datos de dosis-respuesta con dos cepas que son el genotipo Rockefeller y IICC para el Aedes aegypti masculino y femenino. La dosis letal media relativizada en masa para Rockefeller e IICC fue de 0,008 y 0,336 nanogramos por miligramo, respectivamente. Los resultados no revelaron diferencias entre las curvas de dosis-respuesta de los mosquitos hembra y macho dentro de cada cepa.Por lo tanto, los datos de ambos sexos se combinaron para calcular los valores medios de dosis letales. Dado que los intervalos de confianza del 95% para la dosis letal mediana de estas dos cepas no se superpusieron, estos valores se consideraron significativamente diferentes. Además, al calcular las proporciones de resistencia, la cepa IICC fue más de 40 veces más resistente que la cepa Rockefeller susceptible.También se obtuvieron datos de dosis-respuesta para la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, cepa Canton-S, y se encontró que la dosis letal media relativizada en masa era de 0,213 nanogramos por miligramo. La consistencia es crítica, especialmente cuando se almacena y aplica el insecticida y se evalúa la mortalidad. Además, tenga cuidado al manipular el espécimen para evitar daños o muerte no inducidos por el insecticida.Con este método, ahora podemos determinar con precisión la resistencia técnica de una población de mosquitos y cómo las condiciones ambientales afectan la resistencia o cómo la resistencia técnica predice la resistencia práctica.