Flujo de trabajo experimental y de análisis de datos para nanoindentación de materia blanda

Resumen

El protocolo presenta un flujo de trabajo completo para experimentos de nanoindentación de materiales blandos, incluidos hidrogeles y células. En primer lugar, se detallan los pasos experimentales para adquirir datos de espectroscopia de fuerza; luego, el análisis de dichos datos se detalla a través de un software Python de código abierto recientemente desarrollado, que se puede descargar gratis desde GitHub.

Resumen

La nanoindentación se refiere a una clase de técnicas experimentales en las que se utiliza una sonda de fuerza micrométrica para cuantificar las propiedades mecánicas locales de biomateriales blandos y células. Este enfoque ha ganado un papel central en los campos de la mecanobiología, el diseño de biomateriales y la ingeniería de tejidos, para obtener una caracterización mecánica adecuada de materiales blandos con una resolución comparable al tamaño de células individuales (μm). La estrategia más popular para adquirir tales datos experimentales es emplear un microscopio de fuerza atómica (AFM); Si bien este instrumento ofrece una resolución sin precedentes en fuerza (hasta pN) y espacio (sub-nm), su usabilidad a menudo está limitada por su complejidad que impide mediciones rutinarias de indicadores integrales de propiedades mecánicas, como el módulo de Young (E). Una nueva generación de nanoindentadores, como los basados en la tecnología de detección de fibra óptica, ha ganado popularidad recientemente por su facilidad de integración al tiempo que permite aplicar fuerzas sub-nN con resolución espacial μm, por lo que es adecuado para sondear las propiedades mecánicas locales de hidrogeles y células.

En este protocolo, se presenta una guía paso a paso que detalla el procedimiento experimental para adquirir datos de nanoindentación en hidrogeles y células utilizando un nanopenetrador de detección de fibra óptica en la parte superior de la virola disponible comercialmente. Mientras que algunos pasos son específicos para el instrumento utilizado en este documento, el protocolo propuesto se puede tomar como guía para otros dispositivos de nanoindentación, siempre que algunos pasos se adapten de acuerdo con las pautas del fabricante. Además, se presenta un nuevo software Python de código abierto equipado con una interfaz gráfica de usuario fácil de usar para el análisis de datos de nanoindentación, que permite la detección de curvas adquiridas incorrectamente, el filtrado de datos, el cálculo del punto de contacto a través de diferentes procedimientos numéricos, el cálculo convencional de E, así como un análisis más avanzado particularmente adecuado para datos de nanoindentación de células individuales.

Introducción

El papel fundamental de la mecánica en biología está hoy establecido ^1,2. Desde tejidos enteros hasta células individuales, las propiedades mecánicas pueden informar sobre el estado fisiopatológico del biomaterial investigado ^3,4. Por ejemplo, el tejido mamario afectado por el cáncer es más rígido que el tejido sano, un concepto que es la base de la popular prueba de palpación⁵. En particular, recientemente se ha demostrado que la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) causada por el coronavirus 2 del síndrome respiratorio a....

Protocolo

1. Preparación de sustratos/células para mediciones de nanoindentación

1. Siga los pasos indicados en el Protocolo suplementario para la preparación de hidrogeles/células PAAm para experimentos de nanoindentación. El procedimiento se resume en la figura 2.
   NOTA: Los hidrogeles PAAm han sido elegidos ya que son los hidrogeles más comunes utilizados en el campo de la mecanobiología. Sin embargo, el protocolo es igualmente aplicable a cualquier tipo de hidrogel²⁵ (ver Discusión, modificaciones del método).

2. Inicio de....

Resultados

Siguiendo el protocolo, se obtiene un conjunto de curvas F-z . Lo más probable es que el conjunto de datos contenga curvas buenas y curvas que se descartarán antes de continuar con el análisis. En general, las curvas deben descartarse si su forma es diferente de la que se muestra en la Figura 4A. La Figura 5AI muestra un conjunto de datos de ~100 curvas obtenidas en un hidrogel PAAm blando de E 0.8^{KPa 35} esperado carg.......

Discusión

Este protocolo muestra cómo adquirir de forma robusta datos de nanoindentación de espectroscopía de fuerza utilizando un nanoindentador superior de virola disponible comercialmente tanto en hidrogeles como en células individuales. Además, se proporcionan instrucciones para el uso de un software de código abierto programado en Python que comprende un flujo de trabajo preciso para el análisis de datos de nanoindentación.

Pasos críticos en el protocolo
Se ha determina.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 mm coverslips	VWR	631-1577P
35 mm cell treated culture dishes	Greiner CELLSTAR	627160
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
Acrylsilane	Alfa Aesar	L16400
Ammonium Persulfate	Merk	7727-54-0
Bisacrylamide	Merk	110-26-9
Chiaro nanoindenter	Optics 11 Life		no catologue number
Ethanol			general
Fetal bovine serum	Gibco	16140071
High glucose DMEM	Gibco	11995065
Isopropanol			general
Kimwipe	Kimberly Clark	21905-026
Microscope glass slides	VWR	631-1550P
MilliQ system	Merk Millipore	ZR0Q008WW
OP1550 Interferometer	Optics11 Life		no catalogue number
Optics 11 Life probe (k = 0.02-0.005 N/m, R = 3-3.5 um)	Optics 11 Life		no catologue number
Optics 11 Life probe (k = 0.46-0.5 N/m, R = 50-55 um)	Optics 11 Life		no catologue number
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122
RainX rain repellent	RainX	26012
Standard petri dishes (90 mm)	Thermo Scientific	101RTIRR
Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	110-18-9
Vaccum dessicator	Thermo Scientific	531-0250
Software
Data acquisition software (v 3.4.1)	Optics 11 Life
GitHub Desktop (Optional)	Microsoft
Python 3	Python Software Foundation
Visual Studio Code (Optional)	Microsoft