JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Environment

الاستفادة من التصوير المقطعي المحوسب الدقيق لتحليل التفاعلات الطفيلية بين النبات والمضيف

Published: January 12th, 2022

DOI:

10.3791/63423

1Harvard University Herbaria, 2Hanse-Wissenschaftskolleg

Micro-CT هي أداة غير مدمرة يمكنها تحليل الهياكل النباتية في ثلاثة أبعاد. يصف هذا البروتوكول تحضير العينة للاستفادة من التصوير المقطعي المحوسب الدقيق لتحليل بنية النبات الطفيلي ووظيفته. يتم استخدام أنواع مختلفة لتسليط الضوء على مزايا هذه الطريقة عندما تقترن باستعدادات محددة.

أصبح التصوير المقطعي المحوسب الدقيق أداة راسخة في التحقيق في بنية النبات ووظيفته. سمحت طبيعتها غير المدمرة ، جنبا إلى جنب مع إمكانية التصور ثلاثي الأبعاد والتقسيم الافتراضي ، بتحليل جديد ومفصل بشكل متزايد للأعضاء النباتية المعقدة. يمكن أيضا استكشاف التفاعلات بين النباتات ، بما في ذلك بين النباتات الطفيلية ومضيفيها. ومع ذلك ، يصبح تحضير العينة قبل المسح أمرا بالغ الأهمية بسبب التفاعل بين هذه النباتات ، والتي غالبا ما تختلف في تنظيم الأنسجة وتكوينها. علاوة على ذلك ، يجب مراعاة التنوع الواسع للنباتات المزهرة الطفيلية ، بدءا من الأجسام النباتية شديدة الانخفاض إلى الأشجار والأعشاب والشجيرات ، أثناء أخذ العينات ومعالجتها وتحضير المواد المضيفة للطفيليات. هنا يتم وصف نهجين مختلفين لإدخال حلول التباين في الطفيلي و / أو النباتات المضيفة ، مع التركيز على تحليل haustorium. يعزز هذا العضو الاتصال والتواصل بين النباتين. باتباع نهج بسيط ، يمكن استكشاف تفاصيل تنظيم أنسجة haustorium ثلاثية الأبعاد ، كما هو موضح هنا للأنواع الطفيلية euphytoid والكرمة والهدال. كما يسمح اختيار عوامل التباين المحددة ونهج التطبيق بمراقبة مفصلة لانتشار الطفيليات الداخلية داخل الجسم المضيف والكشف عن الاتصال المباشر من سفينة إلى أخرى بين الطفيلي والمضيف ، كما هو موضح هنا لطفيلي جذر ملزم. وبالتالي ، يمكن تطبيق البروتوكول الذي تمت مناقشته هنا على التنوع الواسع للنباتات المزهرة الطفيلية لتعزيز فهم تطورها وهيكلها وعملها.

التصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينية عالي الدقة (micro-CT) هو طريقة تصوير يتم فيها تسجيل صور شعاعية متعددة (إسقاطات) لعينة من زوايا مشاهدة مختلفة وتستخدم لاحقا لتوفير إعادة بناء افتراضية للعينة1. يمكن بعد ذلك تحليل هذا الكائن الافتراضي ومعالجته وتجزئته ، مما يسمح بالاستكشاف غير المدمر في ثلاثة أبعاد2. تم تصميم التصوير المقطعي المحوسب الدقيق في البداية للتحليلات الطبية وبعد ذلك للتطبيقات الصناعية ، كما يوفر ميزة تصور الأعضاء والأنسجة الداخلية دون الحاجة إلى إجراءات جراحية3. مثل أشكال التصوير الأخرى ، يعمل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق مع المفاضلة بين مجال الرؤية وحجم البكسل ، مما يعني أن التصوي....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. اختيار عينة النبات الطفيلي

  1. جمع كامل haustorium النبات الطفيلي ، بما في ذلك الجذع / الجذر المضيف المرفق وأجزاء من كل من الأطراف القريبة والبعيدة للعضو المضيف المتطفل ؛ الطول المثالي لكل قطعة يعادل ضعف قطر Haustorium.
    ملاحظة: بالنسبة إلى haustoria الجانبية ، قم بتضمين جزء من جذع / جذر الأم.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

haustorium من النباتات الطفيلية هو عضو معقد يضم الأنسجة المختلفة وأنواع الخلايا التي تتشابك وتتواصل مع أنسجة نبات آخر ، وتستخدم كمضيف20. يمكن الاستفادة من التصوير المقطعي المحوسب الدقيق لفهم هذا الهيكل المعقد بشكل أفضل بطريقة غير مدمرة وثلاثية الأبعاد عند تحليل كل من ?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

أصبح استخدام محاليل المعادن الثقيلة لتحسين تباين الأنسجة النباتية خطوة حاسمة في تحضير العينات لتحليل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق. تم اختبار العديد من المركبات المتوفرة بشكل شائع في مختبرات التشكل الدقيق للنبات من قبل Staedler et al. ، الذين يوصون باستخدام phosphotungstate كعامل أكثر فعالية في اختر.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

أود أن أشكر الدكتور سيمون غوميز فيريرا (مختبر التصوير المقطعي المجهري ، جامعة ساو باولو ، البرازيل) والدكتور جريج لين (مركز أنظمة النانو ، جامعة هارفارد ، الولايات المتحدة الأمريكية) على مساعدتهم القصوى وتدريب المستخدم الذي لا غنى عنه لأنظمة التصوير المقطعي المجهري المختلفة وبرامج تحليل البيانات. كما أشكر الموظفين في EEB Greenhouse في جامعة كونيتيكت (الولايات المتحدة الأمريكية) ، وخاصة كلينتون مورس وماثيو أوبل لتوفير عينات من الحد الأدنى من Viscum. قدم الدكتور جون وينزل الفرصة والمساعدة الكبيرة لأخذ عينات من Pyrularia pubera. ماجستير كارولينا باستوس ، ماجستير ياسمين هيراو ، وطاليثا موتا ساعدت بشكل كبير في أخذ عينات من فطريات Scybalium. قدم م....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
3D X-ray microscope (XRM) systemZeiss Versa 620used to scan Pyrularia pubera
3D X-ray microscope + A2:D22ZeissVersa 620Used for scanning the species P. pubera
CT-Pro 3D softwareNikonversion XT 3.1.11Used for three-dimensional reconstruction of scans
CT-Vox softwareBrukerversion 3.3.1Used for analyses and acquisition of images and videos
Dragonfly softwareObject Research Systems - ORSversionUsed for analyses and acquisition of images and videos
Glass vialsGlass Vials Inc. SEV2708C-FM-SPSold by VWR - USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi
Inspect-XZeissversion XT 3.1.11Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system
Iodine solution 0.0282 NWR Chemicals BDHBDH7422-1Sold by VWR - USA
Lead Nitrate II PA 500 gVetec361.08Sold by SPLab
Microtomography scannerBrukerSkyscan1176Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme
Microtomography scannerNikonX-Tek HMXST225Used for scanning the species V. minimum
NRecon softwareBrukerversion 1.0.0Used for three-dimensional reconstruction
Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solutionElectron Microscopy Sciences101410-756Sold by VWR - USA
Plastic film (Parafilm)Heathrow ScientificPM996Sold by VWR - USA
Plastic IV bag 500 mLTaylor3478Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude
PVC tubing 3/4''Nalge Nunc InternationalSC63013-164Sold by VWR - USA
Scanning systemNikon X-Tek HMXST225used to scan Viscum minimum
Scanning systemBruker Skyscan 1176used to scan C. americana
Scout-and-ScanTM softwareZeissversion 16Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans
Three-way valveToToTDMTWVS-5Sold by Amazon USA
Two-part syringeHSW Henke-Ject4850001000Used without the plunger
Vacuum chamberBinder80080-434Sold by VWR - USA; includes pump and connecting tubes
VG Studio Max softwareVolume Graphicsversion 3.0Used for analyses and acquisition of images and videos

  1. Stock, S. R. . Microcomputed tomography: Methodology and applications. , (2020).
  2. Hounsfield, G. N. Computerized transverse axial scanning (tomography): I. Description of system. British Journal of Radiology. 46 (552), 1016-1022 (1973).
  3. Dutilleul, P., Lafond, J. A. Editorial: Branching and rooting out with a CT Scanner: The why, the how, and the outcomes, present and possibly future pierre. Frontiers in Plant Science. 7 (41), 5-6 (2016).
  4. Metscher, B. D. Biological applications of X-ray microtomography: Imaging micro- anatomy, molecular expression and organismal diversity. Microscopy and Analysis. 27 (2), 13-16 (2013).
  5. Sakdinawat, A., Attwood, D. Nanoscale X-ray imaging. Nature Photonics. 4 (12), 840-848 (2010).
  6. Walton, L. A., et al. Morphological characterisation of unstained and intact tissue micro-architecture by X-ray computed micro- and nano-tomography. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
  7. Lafond, J. A., Han, L., Dutilleul, P. Concepts and analyses in the ct scanning of root systems and leaf canopies: A timely summary. Frontiers in Plant Science. 6 (1111), 85-91 (2015).
  8. Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via X-Ray Tomography: Simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS ONE. 8 (9), 75295 (2013).
  9. Heeraman, D. A., Hopmans, J. W., Clausnitzer, V. Three dimensional imaging of plant roots in situ with X-ray Computed Tomography. Plant and Soil. 189, 167-179 (1997).
  10. Dhondt, S., Vanhaeren, H., Van Loo, D., Cnudde, V., Inzé, D. Plant structure visualization by high-resolution X-ray computed tomography. Trends in Plant Science. 15 (8), 419-422 (2010).
  11. McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162 (2013).
  12. Cochard, H., Delzon, S., Badel, E. X-ray microtomography (micro-CT): A reference technology for high-resolution quantification of xylem embolism in trees. Plant, Cell and Environment. 38 (1), 201-206 (2015).
  13. Bastos, C. L., Tamaio, N., Angyalossy, V. Unravelling roots of lianas: A case study in Sapindaceae. Annals of Botany. 118 (4), 733-746 (2016).
  14. da Cunha Neto, I. L., et al. Diversity, distribution, development, and evolution of medullary bundles in Nyctaginaceae. American Journal of Botany. 107 (5), 707-725 (2020).
  15. Milien, M., Renault-Spilmont, A. S., Cookson, S. J., Sarrazin, A., Verdeil, J. L. Visualization of the 3D structure of the graft union of grapevine using X-ray tomography. Scientia Horticulturae. 144, 130-140 (2012).
  16. Paya, A. M., Silverberg, J. L., Padgett, J., Bauerle, T. L. X-ray computed tomography uncovers root-root interactions: Quantifying spatial relationships between interacting root systems in three dimensions. Frontiers in Plant Science. 6 (274), 54-65 (2015).
  17. Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. C. T. Aligning microtomography analysis with traditional anatomy for a 3D understanding of the host-parasite interface - Phoradendron spp. Case study. Frontiers in Plant Science. 7, 1340 (2016).
  18. Lusic, H., Grinstaff, M. W. X-ray-computed tomography contrast agents. Chemical Reviews. 113 (3), 1641-1666 (2013).
  19. Těšitel, J. Functional biology of parasitic plants: a review. Plant Ecology and Evolution. 149 (1), 5-20 (2016).
  20. Teixeira-Costa, L. A living bridge between two enemies: Haustorium structure and evolution across parasitic flowering plants. Revista Brasileira de Botanica. 44 (1), 165-178 (2021).
  21. Kuijt, J. . The Biology of Parasitic Flowering Plants. , (1969).
  22. Masumoto, N., et al. Three-dimensional reconstructions of haustoria in two parasitic plant species in the Orobanchaceae. Plant Physiology. 185 (4), 1429-1442 (2021).
  23. Calo, C. M., et al. A correlation analysis of Light Microscopy and X-ray MicroCT imaging methods applied to archaeological plant remains' morphological attributes visualization. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
  24. Brodersen, C. R., Roddy, A. B. New frontiers in the three-dimensional visualization of plant structure and function. American Journal of Botany. 103 (2), 184-188 (2016).
  25. Teixeira-Costa, L., Davis, C. C. Life history, diversity, and distribution in parasitic flowering plants. Plant Physiology. 187 (1), 32-51 (2021).
  26. Simpson, B. B. Krameriaceae. Flora Neotropica Monograph. 49, (1989).
  27. Ruzin, S. E. . Plant microtechnique and microscopy. , (1999).
  28. Nikolov, L. A., Tomlinson, P. B., Manickam, S., Endress, P. K., Kramer, E. M., Davis, C. C. Holoparasitic Rafflesiaceae possess the most reduced endophytes and yet give rise to the world's largest flowers. Annals of Botany. 114, 233-242 (2014).
  29. Thorogood, C. J., Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G., Davis, C., Hiscock, S. J. Endoparasitic plants and fungi show evolutionary convergence across phylogenetic divisions. New Phytologist. 232 (3), 1159-1167 (2021).
  30. Largent, D., Johnson, D., Watling, R. . How to Identify Mushrooms to Genus III: Microscopic Features. , (1977).
  31. Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2293-2298 (2018).
  32. Sperry, J. S., Donnelly, J. R., Tyree, M. T. A method for measuring hydraulic conductivity and embolism in xylem. Plant, Cell and Environment. 11, 35-40 (1988).
  33. Calvin, C. L. Host-formed tyloses in vessels of the mistletoe Phoradendron (Viscaceae). IAWA Journal. 18 (2), 117-126 (1997).
  34. Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. Embolism increase and anatomical modifications caused by a parasitic plant. IAWA Journal. 36 (2), 138-151 (2015).
  35. Ellmore, G. S., Ewers, F. W. Fluid flow in the outermost xylem increment of a ring-porous tree, Ulmus americana. American Journal of Botany. 73 (12), 1771-1774 (1986).
  36. Ellis, E. A. Staining sectioned biological specimens for transmission electron microscopy: Conventional and En bloc stains. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117, 57-72 (2014).
  37. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: In vivo visualizations using high-resolution computed tomography. Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
  38. Brodersen, C. R., et al. Automated analysis of three-dimensional xylem networks using high-resolution computed tomography. New Phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).
  39. Lee, K., et al. Visualizing plant development and gene expression in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18 (9), 2145-2156 (2006).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved