利用显微CT扫描分析寄生植物与宿主的相互作用

显微CT是一种非破坏性工具，可以从三个维度上分析植物结构。本协议描述了利用micro-CT分析寄生植物结构和功能的样品制备。当与特定制剂结合使用时，使用不同的物种来突出该方法的优点。

显微CT扫描已成为研究植物结构和功能的成熟工具。它的非破坏性，加上三维可视化和虚拟切片的可能性，使得对复杂的植物器官进行新颖且越来越详细的分析成为可能。植物之间的相互作用，包括寄生植物与其宿主之间的相互作用，也可以探索。然而，由于这些植物之间的相互作用，扫描前的样品制备变得至关重要，这些植物的组织组织和组成通常不同。此外，在寄生虫宿主材料的取样、处理和制备过程中，必须考虑寄生开花植物的广泛多样性，从高度减少的营养体到树木、草药和灌木。这里描述了将造影剂引入寄生虫和/或寄主植物的两种不同方法，重点是分析造影剂。该器官促进了两种植物之间的联系和交流。遵循简单的方法，可以三维探索Haustorium组织组织的细节，如此处所示的真生，藤本和槲寄生寄生物种。选择特定的造影剂和应用方法还可以详细观察寄生虫在宿主体内的传播，并检测寄生虫和宿主之间的直接血管到血管连接，如此处所示的专性根寄生虫。因此，这里讨论的协议可以应用于寄生开花植物的广泛多样性，以促进对其发育、结构和功能的理解。

高分辨率 X 射线显微计算机断层扫描 （micro-CT） 是一种成像方法，其中从不同的视角记录样品的多张 X 光片（投影），然后用于提供样品的虚拟重建¹。然后可以对该虚拟对象进行分析、操作和分割，从而实现三维非破坏性探索².micro-CT最初设计用于医学分析，后来用于工业应用，还具有可视化内部器官和组织的优势，而无需侵入性程序³。与其他形式的成像一样，显微CT在视场和像素大小之间进行权衡，这意味着大样本的高分辨率成像几乎无法实现⁴。使用高能X射线源（即同步加速器）和二次光学放大倍率方面不断取得进展，使最小分辨率达到100 nm^5，6以下。然而，对于大样品，需要更长的扫描时间，从而增加由于样品移动或扫描仪内部变形而导致伪影的机会。此外，显微CT通常受到样品内自然密度变化以及样品与X射线相互作用的限制。虽然较高的X射线剂量最适合穿透密度较大的样品，但它在捕获样品与其^{周围介质之间}密度变化的效率较低7。另一方面，较低的X射线剂量提供较少的穿透力，并且通常需要更长的扫描时间，但在密度检测中需要更高的灵敏度⁷。

1. 寄生植物样品选择

1. 收集整个寄生植物，包括附着的宿主茎/根以及寄生宿主器官近端和远端的节段;每段的理想长度相当于镰刀直径的两倍。
   注意：对于侧肋骨，包括形成荛膜的寄生虫母茎/根的一部分（图1A，B，D）。对于内寄生虫，收集宿主茎/根的一段，其中寄生虫的迹象可见（图1B）。在端子连接的情况下，应?.......

寄生植物的haustorium是一个复杂的器官，包括不同的组织和细胞类型，它们与另一种植物的组织交织和连接，用作宿主²⁰。在分析小型（图1A-C）和大型（图1D，E）豪斯托里亚时，可以利用显微CT扫描以非破坏性和三维方式更好地了解这种复杂结构。为此，可以将对比溶液应用于寄生虫 - 宿主界?.......

使用重金属溶液提高植物组织对比度已成为显微CT分析样品制备的关键步骤。Staedler等人已经测试了植物微观形态学实验室中常见的几种化合物，他们建议使用磷钨酸盐作为穿透样品和增加对比度指数⁸的最有效剂。在分析P. pubera的Haustorium时获得的结果证实了这一建议。在造影剂应用方面，Steadler等人描述造影剂溶液在1至^{8天内被动}渗透通过分析的材料（花.......

我要感谢Simone Gomes Ferreira博士（巴西圣保罗大学显微断层扫描实验室）和Greg Lin博士（美国哈佛大学纳米系统中心）为不同的显微断层扫描系统和数据分析软件提供了最重要的帮助和不可或缺的用户培训。我还要感谢康涅狄格大学（美国）EEB温室的工作人员，特别是克林顿·莫尔斯和马修·欧宝提供 Viscum最小标本。John Wenzel博士为 耻骨吡咯菌的采样提供了机会和巨大的帮助。MSc. Carolina Bastos，MSc. Yasmin Hirao和Talitha Motta极大地帮助了 Scybalium fungiforme的采样。Ariadne Furtado博士、Fernanda Oliveira博士和Maria Aline Neves博士为使用福洛辛B分析内生真菌提供了参考。布鲁塞尔自由大学的视频录制是在Philippe Claeys博士，Christophe Snoeck博士，Jake Griffith硕士，Barabara Veselka博士和Harry Olde Venterink博士的帮助下实现的。资金由高等教育人员改进协调会（CAPES，巴西）和哈佛大学标本馆（美国）提供。