Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Environment
Die Mikro-CT ist ein zerstörungsfreies Werkzeug, mit dem Pflanzenstrukturen dreidimensional analysiert werden können. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Probenvorbereitung zur Nutzung von Mikro-CT zur Analyse der parasitären Pflanzenstruktur und -funktion. Verschiedene Spezies werden verwendet, um die Vorteile dieser Methode in Verbindung mit spezifischen Präparaten hervorzuheben.
Mikro-CT-Scans haben sich zu einem etablierten Werkzeug zur Untersuchung der Struktur und Funktion von Pflanzen entwickelt. Seine zerstörungsfreie Natur, kombiniert mit der Möglichkeit der dreidimensionalen Visualisierung und virtuellen Schnitte, hat eine neuartige und immer detailliertere Analyse komplexer Pflanzenorgane ermöglicht. Auch die Wechselwirkungen zwischen Pflanzen, auch zwischen parasitären Pflanzen und ihren Wirten, können erforscht werden. Die Probenvorbereitung vor dem Scannen ist jedoch aufgrund der Interaktion zwischen diesen Pflanzen, die sich oft in der Gewebeorganisation und -zusammensetzung unterscheiden, von entscheidender Bedeutung. Darüber hinaus muss bei der Probenahme, Behandlung und Aufbereitung von Parasiten-Wirtsmaterial die große Vielfalt parasitärer Blütenpflanzen berücksichtigt werden, die von stark reduzierten vegetativen Körpern bis hin zu Bäumen, Kräutern und Sträuchern reicht. Hier werden zwei verschiedene Ansätze beschrieben, um Kontrastmittel in den Parasiten und/oder die Wirtspflanzen einzubringen, wobei der Schwerpunkt auf der Analyse des Haustoriums liegt. Dieses Organ fördert die Verbindung und Kommunikation zwischen den beiden Pflanzen. Mit einem einfachen Ansatz können Details der Struktur des Haustoriumsgewebes dreidimensional erforscht werden, wie hier für die parasitären Arten der Euphytoiden, der Rebe und der Mistel gezeigt wird. Die Auswahl spezifischer Kontrastmittel und Applikationsansätze ermöglicht auch eine detaillierte Beobachtung der Ausbreitung von Endoparasiten im Wirtskörper und den Nachweis einer direkten Gefäß-zu-Gefäß-Verbindung zwischen Parasit und Wirt, wie hier für einen obligaten Wurzelparasiten gezeigt. Daher kann das hier diskutierte Protokoll auf die große Vielfalt parasitärer Blütenpflanzen angewendet werden, um das Verständnis ihrer Entwicklung, Struktur und Funktionsweise zu verbessern.
Die hochauflösende Röntgen-Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) ist ein bildgebendes Verfahren, bei dem mehrere Röntgenaufnahmen (Projektionen) einer Probe aus unterschiedlichen Blickwinkeln aufgenommen und später zur virtuellen Rekonstruktion der Probe verwendet werden1. Dieses virtuelle Objekt kann dann analysiert, manipuliert und segmentiert werden, was eine zerstörungsfreie Erkundung in drei Dimensionenermöglicht 2. Ursprünglich für medizinische Analysen und später für industrielle Anwendungen konzipiert, bietet die Mikro-CT auch den Vorteil, innere Organe und Gewebe ohne invasive Eingriffe sichtbar zu machen
1. Auswahl parasitärer Pflanzenproben
Das Haustorium parasitischer Pflanzen ist ein komplexes Organ, das aus verschiedenen Geweben und Zelltypen besteht, die sich mit dem Gewebe einer anderen Pflanze verflechten und verbinden, die als Wirt verwendet wird20. Mikro-CT-Scans können genutzt werden, um diese komplexe Struktur auf zerstörungsfreie und dreidimensionale Weise besser zu verstehen, wenn sowohl kleine (Abbildung 1A-C) als auch große (Abbildung 1D,E.......
Die Verwendung von Schwermetalllösungen zur Verbesserung des Kontrasts von Pflanzengewebe ist zu einem entscheidenden Schritt bei der Probenvorbereitung für die Mikro-CT-Analyse geworden. Staedler et al. haben mehrere Verbindungen, die üblicherweise in Laboratorien für die Mikromorphologie von Pflanzen verfügbar sind, getestet, die die Verwendung von Phosphowolframat als wirksamstes Mittel bei der Penetration von Proben und der Erhöhung des Kontrastindexempfehlen 8. Die hier erzielten Ergebn.......
Ich danke Dr. Simone Gomes Ferreira (Mikrotomographie-Labor, Universität von São Paulo, Brasilien) und Dr. Greg Lin (Center for Nanoscale Systems, Harvard University, USA) für ihre überragende Hilfe und unverzichtbare Anwenderschulung für verschiedene Mikrotomographie-Systeme und Datenanalyse-Software. Ich danke auch den Mitarbeitern des EEB-Gewächshauses an der Universität von Connecticut (USA), insbesondere Clinton Morse und Matthew Opel für die Bereitstellung der Exemplare von Viscum minimum. Dr. John Wenzel bot die Möglichkeit und große Hilfe bei der Probenahme von Pyrularia pubera. MSc. Carolina Bastos, MSc. Yasmin Hirao und Talitha Motta halfen....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3D X-ray microscope (XRM) system | Zeiss Versa 620 | used to scan Pyrularia pubera | |
3D X-ray microscope + A2:D22 | Zeiss | Versa 620 | Used for scanning the species P. pubera |
CT-Pro 3D software | Nikon | version XT 3.1.11 | Used for three-dimensional reconstruction of scans |
CT-Vox software | Bruker | version 3.3.1 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
Dragonfly software | Object Research Systems - ORS | version | Used for analyses and acquisition of images and videos |
Glass vials | Glass Vials Inc. SE | V2708C-FM-SP | Sold by VWR - USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi |
Inspect-X | Zeiss | version XT 3.1.11 | Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system |
Iodine solution 0.0282 N | WR Chemicals BDH | BDH7422-1 | Sold by VWR - USA |
Lead Nitrate II PA 500 g | Vetec | 361.08 | Sold by SPLab |
Microtomography scanner | Bruker | Skyscan1176 | Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme |
Microtomography scanner | Nikon | X-Tek HMXST225 | Used for scanning the species V. minimum |
NRecon software | Bruker | version 1.0.0 | Used for three-dimensional reconstruction |
Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 101410-756 | Sold by VWR - USA |
Plastic film (Parafilm) | Heathrow Scientific | PM996 | Sold by VWR - USA |
Plastic IV bag 500 mL | Taylor | 3478 | Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude |
PVC tubing 3/4'' | Nalge Nunc International | SC63013-164 | Sold by VWR - USA |
Scanning system | Nikon X-Tek HMXST225 | used to scan Viscum minimum | |
Scanning system | Bruker Skyscan 1176 | used to scan C. americana | |
Scout-and-ScanTM software | Zeiss | version 16 | Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans |
Three-way valve | ToToT | DMTWVS-5 | Sold by Amazon USA |
Two-part syringe | HSW Henke-Ject | 4850001000 | Used without the plunger |
Vacuum chamber | Binder | 80080-434 | Sold by VWR - USA; includes pump and connecting tubes |
VG Studio Max software | Volume Graphics | version 3.0 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
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