JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Environment

מינוף סריקת מיקרו-CT לניתוח אינטראקציות טפיליות בין צמח למארח

Published: January 12th, 2022

DOI:

10.3791/63423

1Harvard University Herbaria, 2Hanse-Wissenschaftskolleg

Micro-CT הוא כלי לא הרסני שיכול לנתח מבנים צמחיים בתלת מימד. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הכנת הדגימה כדי למנף מיקרו-CT לניתוח מבנה ותפקוד צמחים טפיליים. מינים שונים משמשים כדי להדגיש את היתרונות של שיטה זו בשילוב עם תכשירים ספציפיים.

סריקת מיקרו-CT הפכה לכלי מבוסס בחקירת מבנה ותפקוד הצמח. טבעו הלא הרסני, בשילוב עם האפשרות של הדמיה תלת מימדית וחתך וירטואלי, איפשר ניתוח חדשני ומפורט יותר ויותר של איברי צמח מורכבים. ניתן לחקור גם אינטראקציות בין צמחים, כולל בין צמחים טפיליים לפונדקאים שלהם. עם זאת, הכנת הדגימה לפני הסריקה הופכת להיות קריטית בשל האינטראקציה בין צמחים אלה, אשר לעתים קרובות שונים בארגון הרקמה ובהרכבה. יתר על כן, יש לקחת בחשבון את המגוון הרחב של צמחים פורחים טפיליים, החל מגופי צומח מצומצמים מאוד ועד עצים, עשבי תיבול ושיחים, במהלך הדגימה, הטיפול וההכנה של חומר פונדקאי טפיל. כאן מתוארות שתי גישות שונות להחדרת תמיסות ניגוד לטפיל ו/או לצמחים פונדקאים, תוך התמקדות בניתוח האוסטוריום. איבר זה מקדם חיבור ותקשורת בין שני הצמחים. בעקבות גישה פשוטה, ניתן לחקור פרטים על ארגון רקמת האוסטוריום באופן תלת-ממדי, כפי שמוצג כאן עבור מינים טפיליים של אופיטואידים, גפנים ודבקונים. בחירת חומרי ניגוד ספציפיים וגישות יישום מאפשרות גם תצפית מפורטת על התפשטות אנדופרזיט בגוף הפונדקאי ואיתור קשר ישיר בין כלי דם לכלי דם בין טפיל לפונדקאי, כפי שמוצג כאן עבור טפיל שורש מחייב. לפיכך, ניתן ליישם את הפרוטוקול הנדון כאן על המגוון הרחב של צמחים פורחים טפיליים כדי לקדם את הבנת התפתחותם, מבנהם ותפקודם.

טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת של קרני רנטגן ברזולוציה גבוהה (micro-CT) היא שיטת הדמיה שבה צילומי רנטגן מרובים (הקרנות) של דגימה נרשמים מזוויות צפייה שונות ומשמשים מאוחר יותר כדי לספק שחזור וירטואלי של המדגם1. לאחר מכן ניתן לנתח, לתפעל ולפלח אובייקט וירטואלי זה, המאפשר חקירה לא הרסנית בשלושה ממדים2. מיקרו-CT, שתוכנן בתחילה עבור ניתוחים רפואיים ומאוחר יותר עבור יישומים תעשייתיים, מציע גם את היתרון של הדמיה של איברים פנימיים ורקמות ללא צורך בהליכים פולשניים3. כמו צורות אחרות של הדמיה, מיקרו-CT עובד עם פשרה בין שדה הראייה לגודל הפיקסל, מה שאומר שהדמיה ברזולוציה גבוהה של דגימות גדולות היא כמעט בלתי מושגת

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. בחירת דגימת צמחים טפיליים

  1. אספו את כל האוסטוריום של הצמח הטפילי, כולל הגבעול/שורש הפונדקאי המצורף ומקטעים של שני הקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים של האיבר המארח הטפילי; האורך האידיאלי של כל קטע שווה להכפיל את קוטר האוסטוריום.
    הערה: עבור האוסטוריה לטרלית, כלול חלק מגבעול/שו?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

האוסטוריום של צמחים טפיליים הוא איבר מורכב המורכב מרקמות וסוגי תאים שונים המשתלבים ומתחברים לרקמות של צמח אחר, המשמש כפונדקאי20. ניתן למנף סריקת מיקרו-CT כדי להבין טוב יותר את המבנה המורכב הזה בדרך לא הרסנית ותלת ממדית בעת ניתוח האוסטוריה קטנה (איור 1A-C) וגד?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

השימוש בתמיסות מתכות כבדות לשיפור הניגודיות של רקמות הצמח הפך לשלב מכריע בהכנת הדגימות לניתוח מיקרו-CT. מספר תרכובות הזמינות בדרך כלל במעבדות מיקרומורפולוגיה של צמחים נבדקו על ידי Staedler et al., אשר ממליצים להשתמש phosphotungstate כסוכן היעיל ביותר בחדירה דגימות והגדלת מדד הניגוד8. תוצאו?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ברצוני להודות לד"ר סימון גומז פריירה (מעבדה למיקרוטומוגרפיה, אוניברסיטת סאו פאולו, ברזיל) ולד"ר גרג לין (המרכז למערכות ננומטריות, אוניברסיטת הרווארד, ארה"ב) על עזרתם החשובה ביותר והדרכת המשתמשים החיונית שלהם עבור מערכות מיקרוטומוגרפיה שונות ותוכנות ניתוח נתונים. אני מודה גם לצוות בחממת EEB באוניברסיטת קונטיקט (ארה"ב), במיוחד לקלינטון מורס ומתיו אופל על שסיפקו את הדגימות של Viscum minimum. ד"ר ג'ון ונצל סיפק את ההזדמנות ועזרה רבה לדגימה של Pyrularia pubera. MSC. קרולינה בסטוס, MSc. יסמין היראו וטליתה מוטה עזרו מאוד בדגימה של פטריות סקיבליום. אריאדנה פורטדו, וד"ר פרננדה אוליביירה וד"ר מריה אלין נבס סיפקו את ההתייחסות לשימוש בפלוקסין B לניתוח פ....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
3D X-ray microscope (XRM) systemZeiss Versa 620used to scan Pyrularia pubera
3D X-ray microscope + A2:D22ZeissVersa 620Used for scanning the species P. pubera
CT-Pro 3D softwareNikonversion XT 3.1.11Used for three-dimensional reconstruction of scans
CT-Vox softwareBrukerversion 3.3.1Used for analyses and acquisition of images and videos
Dragonfly softwareObject Research Systems - ORSversionUsed for analyses and acquisition of images and videos
Glass vialsGlass Vials Inc. SEV2708C-FM-SPSold by VWR - USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi
Inspect-XZeissversion XT 3.1.11Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system
Iodine solution 0.0282 NWR Chemicals BDHBDH7422-1Sold by VWR - USA
Lead Nitrate II PA 500 gVetec361.08Sold by SPLab
Microtomography scannerBrukerSkyscan1176Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme
Microtomography scannerNikonX-Tek HMXST225Used for scanning the species V. minimum
NRecon softwareBrukerversion 1.0.0Used for three-dimensional reconstruction
Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solutionElectron Microscopy Sciences101410-756Sold by VWR - USA
Plastic film (Parafilm)Heathrow ScientificPM996Sold by VWR - USA
Plastic IV bag 500 mLTaylor3478Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude
PVC tubing 3/4''Nalge Nunc InternationalSC63013-164Sold by VWR - USA
Scanning systemNikon X-Tek HMXST225used to scan Viscum minimum
Scanning systemBruker Skyscan 1176used to scan C. americana
Scout-and-ScanTM softwareZeissversion 16Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans
Three-way valveToToTDMTWVS-5Sold by Amazon USA
Two-part syringeHSW Henke-Ject4850001000Used without the plunger
Vacuum chamberBinder80080-434Sold by VWR - USA; includes pump and connecting tubes
VG Studio Max softwareVolume Graphicsversion 3.0Used for analyses and acquisition of images and videos

  1. Stock, S. R. . Microcomputed tomography: Methodology and applications. , (2020).
  2. Hounsfield, G. N. Computerized transverse axial scanning (tomography): I. Description of system. British Journal of Radiology. 46 (552), 1016-1022 (1973).
  3. Dutilleul, P., Lafond, J. A. Editorial: Branching and rooting out with a CT Scanner: The why, the how, and the outcomes, present and possibly future pierre. Frontiers in Plant Science. 7 (41), 5-6 (2016).
  4. Metscher, B. D. Biological applications of X-ray microtomography: Imaging micro- anatomy, molecular expression and organismal diversity. Microscopy and Analysis. 27 (2), 13-16 (2013).
  5. Sakdinawat, A., Attwood, D. Nanoscale X-ray imaging. Nature Photonics. 4 (12), 840-848 (2010).
  6. Walton, L. A., et al. Morphological characterisation of unstained and intact tissue micro-architecture by X-ray computed micro- and nano-tomography. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
  7. Lafond, J. A., Han, L., Dutilleul, P. Concepts and analyses in the ct scanning of root systems and leaf canopies: A timely summary. Frontiers in Plant Science. 6 (1111), 85-91 (2015).
  8. Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via X-Ray Tomography: Simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS ONE. 8 (9), 75295 (2013).
  9. Heeraman, D. A., Hopmans, J. W., Clausnitzer, V. Three dimensional imaging of plant roots in situ with X-ray Computed Tomography. Plant and Soil. 189, 167-179 (1997).
  10. Dhondt, S., Vanhaeren, H., Van Loo, D., Cnudde, V., Inzé, D. Plant structure visualization by high-resolution X-ray computed tomography. Trends in Plant Science. 15 (8), 419-422 (2010).
  11. McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162 (2013).
  12. Cochard, H., Delzon, S., Badel, E. X-ray microtomography (micro-CT): A reference technology for high-resolution quantification of xylem embolism in trees. Plant, Cell and Environment. 38 (1), 201-206 (2015).
  13. Bastos, C. L., Tamaio, N., Angyalossy, V. Unravelling roots of lianas: A case study in Sapindaceae. Annals of Botany. 118 (4), 733-746 (2016).
  14. da Cunha Neto, I. L., et al. Diversity, distribution, development, and evolution of medullary bundles in Nyctaginaceae. American Journal of Botany. 107 (5), 707-725 (2020).
  15. Milien, M., Renault-Spilmont, A. S., Cookson, S. J., Sarrazin, A., Verdeil, J. L. Visualization of the 3D structure of the graft union of grapevine using X-ray tomography. Scientia Horticulturae. 144, 130-140 (2012).
  16. Paya, A. M., Silverberg, J. L., Padgett, J., Bauerle, T. L. X-ray computed tomography uncovers root-root interactions: Quantifying spatial relationships between interacting root systems in three dimensions. Frontiers in Plant Science. 6 (274), 54-65 (2015).
  17. Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. C. T. Aligning microtomography analysis with traditional anatomy for a 3D understanding of the host-parasite interface - Phoradendron spp. Case study. Frontiers in Plant Science. 7, 1340 (2016).
  18. Lusic, H., Grinstaff, M. W. X-ray-computed tomography contrast agents. Chemical Reviews. 113 (3), 1641-1666 (2013).
  19. Těšitel, J. Functional biology of parasitic plants: a review. Plant Ecology and Evolution. 149 (1), 5-20 (2016).
  20. Teixeira-Costa, L. A living bridge between two enemies: Haustorium structure and evolution across parasitic flowering plants. Revista Brasileira de Botanica. 44 (1), 165-178 (2021).
  21. Kuijt, J. . The Biology of Parasitic Flowering Plants. , (1969).
  22. Masumoto, N., et al. Three-dimensional reconstructions of haustoria in two parasitic plant species in the Orobanchaceae. Plant Physiology. 185 (4), 1429-1442 (2021).
  23. Calo, C. M., et al. A correlation analysis of Light Microscopy and X-ray MicroCT imaging methods applied to archaeological plant remains' morphological attributes visualization. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
  24. Brodersen, C. R., Roddy, A. B. New frontiers in the three-dimensional visualization of plant structure and function. American Journal of Botany. 103 (2), 184-188 (2016).
  25. Teixeira-Costa, L., Davis, C. C. Life history, diversity, and distribution in parasitic flowering plants. Plant Physiology. 187 (1), 32-51 (2021).
  26. Simpson, B. B. Krameriaceae. Flora Neotropica Monograph. 49, (1989).
  27. Ruzin, S. E. . Plant microtechnique and microscopy. , (1999).
  28. Nikolov, L. A., Tomlinson, P. B., Manickam, S., Endress, P. K., Kramer, E. M., Davis, C. C. Holoparasitic Rafflesiaceae possess the most reduced endophytes and yet give rise to the world's largest flowers. Annals of Botany. 114, 233-242 (2014).
  29. Thorogood, C. J., Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G., Davis, C., Hiscock, S. J. Endoparasitic plants and fungi show evolutionary convergence across phylogenetic divisions. New Phytologist. 232 (3), 1159-1167 (2021).
  30. Largent, D., Johnson, D., Watling, R. . How to Identify Mushrooms to Genus III: Microscopic Features. , (1977).
  31. Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2293-2298 (2018).
  32. Sperry, J. S., Donnelly, J. R., Tyree, M. T. A method for measuring hydraulic conductivity and embolism in xylem. Plant, Cell and Environment. 11, 35-40 (1988).
  33. Calvin, C. L. Host-formed tyloses in vessels of the mistletoe Phoradendron (Viscaceae). IAWA Journal. 18 (2), 117-126 (1997).
  34. Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. Embolism increase and anatomical modifications caused by a parasitic plant. IAWA Journal. 36 (2), 138-151 (2015).
  35. Ellmore, G. S., Ewers, F. W. Fluid flow in the outermost xylem increment of a ring-porous tree, Ulmus americana. American Journal of Botany. 73 (12), 1771-1774 (1986).
  36. Ellis, E. A. Staining sectioned biological specimens for transmission electron microscopy: Conventional and En bloc stains. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117, 57-72 (2014).
  37. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: In vivo visualizations using high-resolution computed tomography. Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
  38. Brodersen, C. R., et al. Automated analysis of three-dimensional xylem networks using high-resolution computed tomography. New Phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).
  39. Lee, K., et al. Visualizing plant development and gene expression in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18 (9), 2145-2156 (2006).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved