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Micro-CT 스캐닝을 활용하여 기생 식물-숙주 상호작용 분석

Published: January 12th, 2022

DOI:

10.3791/63423

1Harvard University Herbaria, 2Hanse-Wissenschaftskolleg

Micro-CT는 식물 구조를 3차원으로 분석할 수 있는 비파괴 도구입니다. 현재 프로토콜은 기생 식물 구조 및 기능을 분석하기 위해 마이크로 CT를 활용하기 위한 샘플 준비를 설명합니다. 특정 제제와 결합 될 때이 방법의 장점을 강조하기 위해 다른 종이 사용됩니다.

마이크로 CT 스캐닝은 식물의 구조와 기능을 조사하는 데 확립된 도구가 되었습니다. 3차원 시각화 및 가상 절편의 가능성과 결합된 비파괴적 특성으로 인해 복잡한 식물 기관에 대한 새롭고 점점 더 상세한 분석이 가능해졌습니다. 기생 식물과 숙주 사이를 포함하여 식물 간의 상호 작용도 탐구할 수 있습니다. 그러나 스캐닝 전 샘플 준비는 종종 조직 조직과 구성이 다른 이들 식물 간의 상호 작용으로 인해 중요합니다. 또한, 기생충 숙주 물질의 샘플링, 처리 및 준비 중에 고도로 감소된 식물체에서 나무, 허브 및 관목에 이르기까지 기생 꽃 식물의 광범위한 다양성을 고려해야 합니다. 여기에서는 haustorium 분석에 초점을 맞춰 기생충 및/또는 숙주 식물에 대조 용액을 도입하기 위한 두 가지 다른 접근 방식을 설명합니다. 이 기관은 두 식물 사이의 연결과 의사 소통을 촉진합니다. 간단한 접근 방식에 따라 euphytoid, 포도 나무 및 겨우살이 기생 종에 대해 여기에 표시된 것처럼 haustorium 조직 조직의 세부 사항을 3차원으로 탐색할 수 있습니다. 특정 조영제 및 적용 접근법을 선택하면 숙주 체내 기생충 확산을 자세히 관찰하고 여기에 표시된 것처럼 기생충과 숙주 사이의 직접적인 혈관 간 연결을 감지할 수 있습니다. 따라서 여기에서 논의된 프로토콜은 기생 꽃 식물의 광범위한 다양성에 적용하여 발달, 구조 및 기능에 대한 이해를 높일 수 있습니다.

고해상도 X선 마이크로컴퓨터 단층촬영(micro-CT)은 샘플의 여러 방사선 사진(투영)을 서로 다른 시야각에서 기록하고나중에 샘플의 가상 재구성을 제공하는 데 사용하는 이미징 방법입니다1. 그런 다음 이 가상 개체를 분석, 조작 및 분할하여 3차원에서 비파괴 탐색이 가능합니다2. 처음에는 의료 분석용으로 설계되었다가 나중에는 산업 응용 분야를 위해 설계된 micro-CT는 침습적 절차 없이 내부 장기와 조직을 시각화할 수 있는 이점도 제공합니다3. 다른 형태의 이미징과 마찬가지로 마이크로 CT는 시야와 픽셀 크기 사이의 균형을 유지하므로 큰 샘플의 고해상도 이미징은 거의 달성할 수 없습니다4. 고 에너지 X 선 소스 (즉, 싱크로트론) 및 2 차 광학 배율 사용의 발전이 지속적으로 이루어지고 있으며, 가장 작은 해상도가 100 nm 5,6 미만에 도달 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 큰 샘플의 경우 더 긴 스캔 시간이 필요하므로 스캐너 내부의 샘플 이동 또는 변형으로 인한 아티팩트 가능성이 높아집니다. 또한 마이크....

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1. 기생 식물 샘플 선택

  1. 부착된 숙주 줄기/뿌리 및 기생된 숙주 기관의 근위 및 원위 말단의 세그먼트를 포함하여 전체 기생 식물 haustorium을 수집합니다. 각 세그먼트의 이상적인 길이는 하우스 토리움 직경의 두 배에 해당합니다.
    참고: 외측 haustoria의 경우 haustorium이 형성된 기생충 모체 줄기/뿌리의 일부를 포함합니다(그림 1A,B,D). 내부 기?.......

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기생 식물의 하우스토리엄(haustorium)은 숙주(host20)로 사용되는 다른 식물의 조직과 서로 얽히고 연결되는 상이한 조직 및 세포 유형을 포함하는 복잡한 기관이다. Micro-CT 스캐닝은 소형(그림 1A-C)과 대형(그림 1D,E)을 모두 분석할 때 비파괴적이고 3차원적인 방식으로 이 복잡한 구조를 더 잘 이해하는 데

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식물 조직 대비를 개선하기 위해 중금속 용액을 사용하는 것은 마이크로 CT 분석을 위한 샘플 준비에서 중요한 단계가 되었습니다. Staedler et al.은 식물 미세 형태학 실험실에서 일반적으로 사용할 수있는 몇 가지 화합물을 테스트했으며, 샘플을 관통하고 대비 지수를 높이는 데 가장 효과적인 약제로 포스 포 텅스텐 산염을 사용할 것을 권장합니다8. P. pubera 의 하우스 토리.......

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다양한 현미경 촬영 시스템 및 데이터 분석 소프트웨어에 대한 최고의 도움과 필수 사용자 교육을 제공한 Simone Gomes Ferreira 박사(브라질 상파울루 대학교 현미경 촬영 실험실)와 Greg Lin 박사(미국 하버드 대학교 나노스케일 시스템 센터)에게 감사드립니다. 또한 미국 코네티컷 대학의 EEB 온실 직원, 특히 최소 비스쿰 표본을 제공한 클린턴 모스와 매튜 오펠에게도 감사드립니다. John Wenzel 박사는 Pyrularia pubera의 샘플링에 대한 기회와 큰 도움을 제공했습니다. 석사 Carolina Bastos, 석사 Yasmin Hirao 및 Talitha Motta는 Scybalium fungiforme의 샘플링에 큰 도움을 주었습니다. 석사 Ariadne Furtado, Drs. Fernanda Oliveira와 Maria Aline Neves는 내생 균류 분석을 위한 플록신 B의 사용에 대한 참고 자료를 제공했습니다. Vrije Universiteit Brussel의 비디오 녹화는 Philippe Claeys 박사, Christophe Snoeck 박사, Jake Griffith 박사, Barabara Veselka 박사 및 Harry Olde Venterink 박사의 도움으로 가능했습니다. 자금은 고등 교육 인....

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NameCompanyCatalog NumberComments
3D X-ray microscope (XRM) systemZeiss Versa 620used to scan Pyrularia pubera
3D X-ray microscope + A2:D22ZeissVersa 620Used for scanning the species P. pubera
CT-Pro 3D softwareNikonversion XT 3.1.11Used for three-dimensional reconstruction of scans
CT-Vox softwareBrukerversion 3.3.1Used for analyses and acquisition of images and videos
Dragonfly softwareObject Research Systems - ORSversionUsed for analyses and acquisition of images and videos
Glass vialsGlass Vials Inc. SEV2708C-FM-SPSold by VWR - USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi
Inspect-XZeissversion XT 3.1.11Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system
Iodine solution 0.0282 NWR Chemicals BDHBDH7422-1Sold by VWR - USA
Lead Nitrate II PA 500 gVetec361.08Sold by SPLab
Microtomography scannerBrukerSkyscan1176Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme
Microtomography scannerNikonX-Tek HMXST225Used for scanning the species V. minimum
NRecon softwareBrukerversion 1.0.0Used for three-dimensional reconstruction
Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solutionElectron Microscopy Sciences101410-756Sold by VWR - USA
Plastic film (Parafilm)Heathrow ScientificPM996Sold by VWR - USA
Plastic IV bag 500 mLTaylor3478Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude
PVC tubing 3/4''Nalge Nunc InternationalSC63013-164Sold by VWR - USA
Scanning systemNikon X-Tek HMXST225used to scan Viscum minimum
Scanning systemBruker Skyscan 1176used to scan C. americana
Scout-and-ScanTM softwareZeissversion 16Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans
Three-way valveToToTDMTWVS-5Sold by Amazon USA
Two-part syringeHSW Henke-Ject4850001000Used without the plunger
Vacuum chamberBinder80080-434Sold by VWR - USA; includes pump and connecting tubes
VG Studio Max softwareVolume Graphicsversion 3.0Used for analyses and acquisition of images and videos

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