Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Environment
Micro-CT er et ikke-destruktivt verktøy som kan analysere plantestrukturer i tre dimensjoner. Den foreliggende protokollen beskriver prøveprepareringen for å utnytte mikro-CT for å analysere parasittisk plantestruktur og funksjon. Ulike arter brukes til å markere fordelene ved denne metoden når de kombineres med spesifikke preparater.
Micro-CT-skanning har blitt et etablert verktøy for å undersøke anleggets struktur og funksjon. Dens ikke-destruktive natur, kombinert med muligheten for tredimensjonal visualisering og virtuell seksjonering, har tillatt ny og stadig mer detaljert analyse av komplekse planteorganer. Interaksjoner mellom planter, inkludert mellom parasittiske planter og deres verter, kan også utforskes. Imidlertid blir prøvepreparering før skanning avgjørende på grunn av samspillet mellom disse plantene, som ofte varierer i vevsorganisasjon og sammensetning. Videre må det brede mangfoldet av parasittiske blomstrende planter, alt fra sterkt reduserte vegetative kropper til trær, urter og busker, vurderes under prøvetaking, behandling og tilberedning av parasittvertsmateriale. Her beskrives to ulike tilnærminger for å introdusere kontrastløsninger i parasitten og/eller vertsplantene, med fokus på å analysere haustorium. Dette organet fremmer forbindelse og kommunikasjon mellom de to plantene. Etter en enkel tilnærming kan detaljer om haustoriumvevsorganisasjon utforskes tredimensjonalt, som vist her for eufytoide, vinranker og mistelteinparasittiske arter. Valg av spesifikke kontrastmidler og applikasjonsmetoder tillater også detaljert observasjon av endoparasittspredning i vertskroppen og påvisning av direkte kar-til-fartøy-forbindelse mellom parasitt og vert, som vist her for en obligatorisk rotparasitt. Dermed kan protokollen diskutert her brukes på det brede mangfoldet av parasittiske blomstrende planter for å fremme forståelsen av deres utvikling, struktur og funksjon.
Høyoppløselig røntgenmikrocomputertomografi (mikro-CT) er en avbildningsmetode der flere røntgenbilder (projeksjoner) av en prøve registreres fra forskjellige synsvinkler og senere brukes til å gi en virtuell rekonstruksjon av prøven1. Dette virtuelle objektet kan deretter analyseres, manipuleres og segmenteres, noe som tillater ikke-destruktiv utforskning i tre dimensjoner2. Opprinnelig designet for medisinske analyser og senere for industrielle applikasjoner, gir micro-CT også fordelen av å visualisere indre organer og vev uten behov for invasive prosedyrer3. Som andre former for bildebehandling....
1. Valg av parasittisk planteprøve
Haustorium av parasittiske planter er et komplekst organ som består av forskjellige vev og celletyper som blander seg og forbinder med vevet til en annen plante, brukt som vert20. Micro-CT-skanning kan utnyttes for å bedre forstå denne komplekse strukturen på en ikke-destruktiv og tredimensjonal måte når man analyserer både små (figur 1A-C) og store (figur 1D, E) haustoria. F.......
Bruken av tungmetallløsninger for å forbedre kontrasten av plantevev har blitt et avgjørende skritt i prøvepreparering for mikro-CT-analyse. Flere forbindelser som vanligvis er tilgjengelige i plantemikromorfologilaboratorier, har blitt testet av Staedler et al., som anbefaler å bruke fosfotungtilstand som det mest effektive middelet i penetrerende prøver og økende kontrastindeks8. Resultater oppnådd her i analysen av haustorium av P. pubera bekrefter denne anbefalingen. Når det .......
Jeg vil gjerne takke Dr. Simone Gomes Ferreira (Microtomography Laboratory, University of Sao Paulo, Brasil) og Dr. Greg Lin (Center for Nanoscale Systems, Harvard University, USA) for deres avgjørende hjelp og uunnværlig brukeropplæring for ulike mikrotomografisystemer og dataanalyseprogramvare. Jeg takker også de ansatte ved EEB Greenhouse ved University of Connecticut (USA), spesielt Clinton Morse og Matthew Opel for å gi eksemplarer av Viscum minimum. Dr. John Wenzel ga muligheten og stor hjelp til prøvetaking av Pyrularia pubera. MSc. Carolina Bastos, MSc. Yasmin Hirao og Talitha Motta hjalp sterkt med prøvetaking av Scybalium fungiforme
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3D X-ray microscope (XRM) system | Zeiss Versa 620 | used to scan Pyrularia pubera | |
3D X-ray microscope + A2:D22 | Zeiss | Versa 620 | Used for scanning the species P. pubera |
CT-Pro 3D software | Nikon | version XT 3.1.11 | Used for three-dimensional reconstruction of scans |
CT-Vox software | Bruker | version 3.3.1 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
Dragonfly software | Object Research Systems - ORS | version | Used for analyses and acquisition of images and videos |
Glass vials | Glass Vials Inc. SE | V2708C-FM-SP | Sold by VWR - USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi |
Inspect-X | Zeiss | version XT 3.1.11 | Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system |
Iodine solution 0.0282 N | WR Chemicals BDH | BDH7422-1 | Sold by VWR - USA |
Lead Nitrate II PA 500 g | Vetec | 361.08 | Sold by SPLab |
Microtomography scanner | Bruker | Skyscan1176 | Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme |
Microtomography scanner | Nikon | X-Tek HMXST225 | Used for scanning the species V. minimum |
NRecon software | Bruker | version 1.0.0 | Used for three-dimensional reconstruction |
Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 101410-756 | Sold by VWR - USA |
Plastic film (Parafilm) | Heathrow Scientific | PM996 | Sold by VWR - USA |
Plastic IV bag 500 mL | Taylor | 3478 | Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude |
PVC tubing 3/4'' | Nalge Nunc International | SC63013-164 | Sold by VWR - USA |
Scanning system | Nikon X-Tek HMXST225 | used to scan Viscum minimum | |
Scanning system | Bruker Skyscan 1176 | used to scan C. americana | |
Scout-and-ScanTM software | Zeiss | version 16 | Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans |
Three-way valve | ToToT | DMTWVS-5 | Sold by Amazon USA |
Two-part syringe | HSW Henke-Ject | 4850001000 | Used without the plunger |
Vacuum chamber | Binder | 80080-434 | Sold by VWR - USA; includes pump and connecting tubes |
VG Studio Max software | Volume Graphics | version 3.0 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved