JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Environment

Использование микро-КТ-сканирования для анализа паразитических взаимодействий между растением и хозяином

Published: January 12th, 2022

DOI:

10.3791/63423

1Harvard University Herbaria, 2Hanse-Wissenschaftskolleg

Микро-КТ - это неразрушающий инструмент, который может анализировать структуры растений в трех измерениях. В настоящем протоколе описана пробоподготовка с использованием микро-КТ для анализа структуры и функции паразитарных растений. Различные виды используются, чтобы подчеркнуть преимущества этого метода в сочетании с конкретными препаратами.

Микро-КТ-сканирование стало признанным инструментом для исследования структуры и функции растений. Его неразрушающий характер в сочетании с возможностью трехмерной визуализации и виртуального разреза позволил по-новому и все более детально анализировать сложные органы растений. Также могут быть изучены взаимодействия между растениями, в том числе между растениями-паразитами и их хозяевами. Однако подготовка образца перед сканированием становится решающей из-за взаимодействия между этими растениями, которые часто различаются по организации и составу тканей. Кроме того, при отборе проб, обработке и подготовке материала паразита-хозяина необходимо учитывать широкое разнообразие паразитических цветковых растений, начиная от сильно редуцированных вегетативных тел и заканчивая деревьями, травами и кустарниками. Здесь описаны два различных подхода к введению контрастных растворов в растения-паразиты и/или растения-хозяева, уделяя особое внимание анализу гаустория. Этот орган способствует связи и общению между двумя растениями. Следуя простому подходу, детали организации ткани гаустория могут быть исследованы в трех измерениях, как показано здесь для видов эуфотоидов, виноградной лозы и омелы. Выбор специфических контрастных агентов и подходов к применению также позволяет детально наблюдать за распространением эндопаразита в организме хозяина и обнаруживать прямую связь между сосудами и хозяином, как показано здесь для облигатного корневого паразита. Таким образом, обсуждаемый здесь протокол может быть применен к широкому разнообразию паразитических цветковых растений для улучшения понимания их развития, структуры и функционирования.

Рентгеновская микрокомпьютерная томография высокого разрешения (микро-КТ) представляет собой метод визуализации, при котором несколько рентгенограмм (проекций) образца записываются под разными углами обзора и в дальнейшем используются для обеспечения виртуальной реконструкции образца1. Затем этот виртуальный объект можно анализировать, манипулировать и сегментировать, что позволяет проводить неразрушающее исследование в трех измерениях2. Первоначально разработанная для медицинских анализов, а затем для промышленного применения, микро-КТ также предлагает преимущество визуализации внутренних органов и тканей без необходимо....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Отбор образцов растений-паразитов

  1. Соберите весь паразитический гаусторий растения, включая прикрепленный стебель/корень хозяина и сегменты как проксимального, так и дистального концов паразитированного органа хозяина; Идеальная длина каждого сегмента эквивалентна ?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Гаусторий растений-паразитов представляет собой сложный орган, состоящий из различных тканей и типов клеток, которые переплетаются и соединяются с тканями другого растения, используемого в качестве хозяина20. Микро-КТ-сканирование может быть использовано для ?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Использование растворов тяжелых металлов для улучшения контраста тканей растений стало важным шагом в подготовке образцов для микро-КТ-анализа. Несколько соединений, обычно доступных в лабораториях микроморфологии растений, были протестированы Staedler et al., которые рекомендуют использ?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Я хотел бы поблагодарить д-ра Симону Гомес Феррейру (Лаборатория микротомографии, Университет Сан-Паулу, Бразилия) и д-ра Грега Лина (Центр наноразмерных систем, Гарвардский университет, США) за их первостепенную помощь и незаменимую подготовку пользователей для работы с различными системами микротомографии и программным обеспечением для анализа данных. Я также благодарю сотрудников EEB Greenhouse в Университете Коннектикута (США), особенно Клинтона Морса и Мэтью Опеля за предоставление образцов минимума Viscum. Д-р Джон Венцель предоставил возможность и большую помощь в отборе проб Pyrularia pubera. Магистры наук Каролина Бастос, магистр наук Ясмин ....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
3D X-ray microscope (XRM) systemZeiss Versa 620used to scan Pyrularia pubera
3D X-ray microscope + A2:D22ZeissVersa 620Used for scanning the species P. pubera
CT-Pro 3D softwareNikonversion XT 3.1.11Used for three-dimensional reconstruction of scans
CT-Vox softwareBrukerversion 3.3.1Used for analyses and acquisition of images and videos
Dragonfly softwareObject Research Systems - ORSversionUsed for analyses and acquisition of images and videos
Glass vialsGlass Vials Inc. SEV2708C-FM-SPSold by VWR - USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi
Inspect-XZeissversion XT 3.1.11Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system
Iodine solution 0.0282 NWR Chemicals BDHBDH7422-1Sold by VWR - USA
Lead Nitrate II PA 500 gVetec361.08Sold by SPLab
Microtomography scannerBrukerSkyscan1176Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme
Microtomography scannerNikonX-Tek HMXST225Used for scanning the species V. minimum
NRecon softwareBrukerversion 1.0.0Used for three-dimensional reconstruction
Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solutionElectron Microscopy Sciences101410-756Sold by VWR - USA
Plastic film (Parafilm)Heathrow ScientificPM996Sold by VWR - USA
Plastic IV bag 500 mLTaylor3478Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude
PVC tubing 3/4''Nalge Nunc InternationalSC63013-164Sold by VWR - USA
Scanning systemNikon X-Tek HMXST225used to scan Viscum minimum
Scanning systemBruker Skyscan 1176used to scan C. americana
Scout-and-ScanTM softwareZeissversion 16Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans
Three-way valveToToTDMTWVS-5Sold by Amazon USA
Two-part syringeHSW Henke-Ject4850001000Used without the plunger
Vacuum chamberBinder80080-434Sold by VWR - USA; includes pump and connecting tubes
VG Studio Max softwareVolume Graphicsversion 3.0Used for analyses and acquisition of images and videos

  1. Stock, S. R. . Microcomputed tomography: Methodology and applications. , (2020).
  2. Hounsfield, G. N. Computerized transverse axial scanning (tomography): I. Description of system. British Journal of Radiology. 46 (552), 1016-1022 (1973).
  3. Dutilleul, P., Lafond, J. A. Editorial: Branching and rooting out with a CT Scanner: The why, the how, and the outcomes, present and possibly future pierre. Frontiers in Plant Science. 7 (41), 5-6 (2016).
  4. Metscher, B. D. Biological applications of X-ray microtomography: Imaging micro- anatomy, molecular expression and organismal diversity. Microscopy and Analysis. 27 (2), 13-16 (2013).
  5. Sakdinawat, A., Attwood, D. Nanoscale X-ray imaging. Nature Photonics. 4 (12), 840-848 (2010).
  6. Walton, L. A., et al. Morphological characterisation of unstained and intact tissue micro-architecture by X-ray computed micro- and nano-tomography. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
  7. Lafond, J. A., Han, L., Dutilleul, P. Concepts and analyses in the ct scanning of root systems and leaf canopies: A timely summary. Frontiers in Plant Science. 6 (1111), 85-91 (2015).
  8. Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via X-Ray Tomography: Simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS ONE. 8 (9), 75295 (2013).
  9. Heeraman, D. A., Hopmans, J. W., Clausnitzer, V. Three dimensional imaging of plant roots in situ with X-ray Computed Tomography. Plant and Soil. 189, 167-179 (1997).
  10. Dhondt, S., Vanhaeren, H., Van Loo, D., Cnudde, V., Inzé, D. Plant structure visualization by high-resolution X-ray computed tomography. Trends in Plant Science. 15 (8), 419-422 (2010).
  11. McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162 (2013).
  12. Cochard, H., Delzon, S., Badel, E. X-ray microtomography (micro-CT): A reference technology for high-resolution quantification of xylem embolism in trees. Plant, Cell and Environment. 38 (1), 201-206 (2015).
  13. Bastos, C. L., Tamaio, N., Angyalossy, V. Unravelling roots of lianas: A case study in Sapindaceae. Annals of Botany. 118 (4), 733-746 (2016).
  14. da Cunha Neto, I. L., et al. Diversity, distribution, development, and evolution of medullary bundles in Nyctaginaceae. American Journal of Botany. 107 (5), 707-725 (2020).
  15. Milien, M., Renault-Spilmont, A. S., Cookson, S. J., Sarrazin, A., Verdeil, J. L. Visualization of the 3D structure of the graft union of grapevine using X-ray tomography. Scientia Horticulturae. 144, 130-140 (2012).
  16. Paya, A. M., Silverberg, J. L., Padgett, J., Bauerle, T. L. X-ray computed tomography uncovers root-root interactions: Quantifying spatial relationships between interacting root systems in three dimensions. Frontiers in Plant Science. 6 (274), 54-65 (2015).
  17. Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. C. T. Aligning microtomography analysis with traditional anatomy for a 3D understanding of the host-parasite interface - Phoradendron spp. Case study. Frontiers in Plant Science. 7, 1340 (2016).
  18. Lusic, H., Grinstaff, M. W. X-ray-computed tomography contrast agents. Chemical Reviews. 113 (3), 1641-1666 (2013).
  19. Těšitel, J. Functional biology of parasitic plants: a review. Plant Ecology and Evolution. 149 (1), 5-20 (2016).
  20. Teixeira-Costa, L. A living bridge between two enemies: Haustorium structure and evolution across parasitic flowering plants. Revista Brasileira de Botanica. 44 (1), 165-178 (2021).
  21. Kuijt, J. . The Biology of Parasitic Flowering Plants. , (1969).
  22. Masumoto, N., et al. Three-dimensional reconstructions of haustoria in two parasitic plant species in the Orobanchaceae. Plant Physiology. 185 (4), 1429-1442 (2021).
  23. Calo, C. M., et al. A correlation analysis of Light Microscopy and X-ray MicroCT imaging methods applied to archaeological plant remains' morphological attributes visualization. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
  24. Brodersen, C. R., Roddy, A. B. New frontiers in the three-dimensional visualization of plant structure and function. American Journal of Botany. 103 (2), 184-188 (2016).
  25. Teixeira-Costa, L., Davis, C. C. Life history, diversity, and distribution in parasitic flowering plants. Plant Physiology. 187 (1), 32-51 (2021).
  26. Simpson, B. B. Krameriaceae. Flora Neotropica Monograph. 49, (1989).
  27. Ruzin, S. E. . Plant microtechnique and microscopy. , (1999).
  28. Nikolov, L. A., Tomlinson, P. B., Manickam, S., Endress, P. K., Kramer, E. M., Davis, C. C. Holoparasitic Rafflesiaceae possess the most reduced endophytes and yet give rise to the world's largest flowers. Annals of Botany. 114, 233-242 (2014).
  29. Thorogood, C. J., Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G., Davis, C., Hiscock, S. J. Endoparasitic plants and fungi show evolutionary convergence across phylogenetic divisions. New Phytologist. 232 (3), 1159-1167 (2021).
  30. Largent, D., Johnson, D., Watling, R. . How to Identify Mushrooms to Genus III: Microscopic Features. , (1977).
  31. Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2293-2298 (2018).
  32. Sperry, J. S., Donnelly, J. R., Tyree, M. T. A method for measuring hydraulic conductivity and embolism in xylem. Plant, Cell and Environment. 11, 35-40 (1988).
  33. Calvin, C. L. Host-formed tyloses in vessels of the mistletoe Phoradendron (Viscaceae). IAWA Journal. 18 (2), 117-126 (1997).
  34. Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. Embolism increase and anatomical modifications caused by a parasitic plant. IAWA Journal. 36 (2), 138-151 (2015).
  35. Ellmore, G. S., Ewers, F. W. Fluid flow in the outermost xylem increment of a ring-porous tree, Ulmus americana. American Journal of Botany. 73 (12), 1771-1774 (1986).
  36. Ellis, E. A. Staining sectioned biological specimens for transmission electron microscopy: Conventional and En bloc stains. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117, 57-72 (2014).
  37. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: In vivo visualizations using high-resolution computed tomography. Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
  38. Brodersen, C. R., et al. Automated analysis of three-dimensional xylem networks using high-resolution computed tomography. New Phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).
  39. Lee, K., et al. Visualizing plant development and gene expression in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18 (9), 2145-2156 (2006).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved