Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Environment
Micro-CT är ett icke-destruktivt verktyg som kan analysera växtstrukturer i tre dimensioner. Det nuvarande protokollet beskriver provberedningen för att utnyttja mikro-CT för att analysera parasitisk växtstruktur och funktion. Olika arter används för att lyfta fram fördelarna med denna metod när de kombineras med specifika preparat.
Mikro-CT-skanning har blivit ett etablerat verktyg för att undersöka växters struktur och funktion. Dess icke-destruktiva natur, i kombination med möjligheten till tredimensionell visualisering och virtuell sektionering, har möjliggjort ny och alltmer detaljerad analys av komplexa växtorgan. Interaktioner mellan växter, inklusive mellan parasitiska växter och deras värdar, kan också utforskas. Provberedning före skanning blir dock avgörande på grund av interaktionen mellan dessa växter, som ofta skiljer sig åt i vävnadsorganisation och sammansättning. Dessutom måste den breda mångfalden av parasitiska blommande växter, allt från starkt reducerade vegetativa kroppar till träd, örter och buskar, beaktas vid provtagning, behandling och beredning av parasitvärdmaterial. Här beskrivs två olika tillvägagångssätt för att införa kontrastlösningar i parasiten och/eller värdväxterna, med fokus på att analysera haustorium. Detta organ främjar anslutning och kommunikation mellan de två växterna. Efter ett enkelt tillvägagångssätt kan detaljer om haustoriumvävnadsorganisation utforskas tredimensionellt, som visas här för euphytoid-, vinstock- och mistelparasitiska arter. Val av specifika kontrastmedel och appliceringsmetoder möjliggör också detaljerad observation av endoparasitspridning inom värdkroppen och detektering av direkt kärl-till-kärlanslutning mellan parasit och värd, som visas här för en obligatorisk rotparasit. Således kan protokollet som diskuteras här tillämpas på den stora mångfalden av parasitiska blommande växter för att främja förståelsen för deras utveckling, struktur och funktion.
Högupplöst röntgenmikrodatortomografi (mikro-CT) är en avbildningsmetod där flera röntgenbilder (projektioner) av ett prov registreras från olika betraktningsvinklar och senare används för att ge en virtuell rekonstruktion av provet1. Detta virtuella objekt kan sedan analyseras, manipuleras och segmenteras, vilket möjliggör icke-destruktiv utforskning i tre dimensioner2. Ursprungligen utformad för medicinska analyser och senare för industriella applikationer, erbjuder mikro-CT också fördelen att visualisera inre organ och vävnader utan behov av invasiva procedurer3. Liksom andra former av avbildni....
1. Urval av parasitiska växtprover
Haustorium av parasitiska växter är ett komplext organ som består av olika vävnader och celltyper som sammanflätas och förbinder med vävnaderna hos en annan växt, som används som värd20. Mikro-CT-skanning kan utnyttjas för att bättre förstå denna komplexa struktur på ett icke-destruktivt och tredimensionellt sätt vid analys av både små (figur 1A-C) och stora (figur 1D, E) haustoria.
Användningen av tungmetalllösningar för att förbättra växtvävnadskontrasten har blivit ett avgörande steg i provberedningen för mikro-CT-analys. Flera föreningar som vanligtvis finns i växtmikromorfologiska laboratorier har testats av Staedler et al., som rekommenderar att man använder fosfotungstat som det mest effektiva medlet för att penetrera prover och öka kontrastindex8. Resultat som erhållits här i analysen av haustorium av P. pubera bekräftar denna rekommendation........
Jag vill tacka Dr. Simone Gomes Ferreira (Microtomography Laboratory, University of Sao Paulo, Brasilien) och Dr. Greg Lin (Center for Nanoscale Systems, Harvard University, USA) för deras avgörande hjälp och oumbärliga användarutbildning för olika mikrotomografisystem och dataanalysprogram. Jag tackar också personalen vid EEB Greenhouse vid University of Connecticut (USA), särskilt Clinton Morse och Matthew Opel för att ha tillhandahållit proverna av Viscum minimum. Dr John Wenzel gav möjlighet och stor hjälp för provtagning av Pyrularia pubera. Carolina Bastos, Yasmin Hira och Talitha Motta hjälpte till med provtagningen av Scybalium fungiforme....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3D X-ray microscope (XRM) system | Zeiss Versa 620 | used to scan Pyrularia pubera | |
3D X-ray microscope + A2:D22 | Zeiss | Versa 620 | Used for scanning the species P. pubera |
CT-Pro 3D software | Nikon | version XT 3.1.11 | Used for three-dimensional reconstruction of scans |
CT-Vox software | Bruker | version 3.3.1 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
Dragonfly software | Object Research Systems - ORS | version | Used for analyses and acquisition of images and videos |
Glass vials | Glass Vials Inc. SE | V2708C-FM-SP | Sold by VWR - USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi |
Inspect-X | Zeiss | version XT 3.1.11 | Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system |
Iodine solution 0.0282 N | WR Chemicals BDH | BDH7422-1 | Sold by VWR - USA |
Lead Nitrate II PA 500 g | Vetec | 361.08 | Sold by SPLab |
Microtomography scanner | Bruker | Skyscan1176 | Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme |
Microtomography scanner | Nikon | X-Tek HMXST225 | Used for scanning the species V. minimum |
NRecon software | Bruker | version 1.0.0 | Used for three-dimensional reconstruction |
Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 101410-756 | Sold by VWR - USA |
Plastic film (Parafilm) | Heathrow Scientific | PM996 | Sold by VWR - USA |
Plastic IV bag 500 mL | Taylor | 3478 | Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude |
PVC tubing 3/4'' | Nalge Nunc International | SC63013-164 | Sold by VWR - USA |
Scanning system | Nikon X-Tek HMXST225 | used to scan Viscum minimum | |
Scanning system | Bruker Skyscan 1176 | used to scan C. americana | |
Scout-and-ScanTM software | Zeiss | version 16 | Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans |
Three-way valve | ToToT | DMTWVS-5 | Sold by Amazon USA |
Two-part syringe | HSW Henke-Ject | 4850001000 | Used without the plunger |
Vacuum chamber | Binder | 80080-434 | Sold by VWR - USA; includes pump and connecting tubes |
VG Studio Max software | Volume Graphics | version 3.0 | Used for analyses and acquisition of images and videos |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved