JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Environment

Parazitik bitki-konakçı etkileşimlerini analiz etmek için mikro-BT taramasından yararlanma

Published: January 12th, 2022

DOI:

10.3791/63423

1Harvard University Herbaria, 2Hanse-Wissenschaftskolleg

Mikro-BT, bitki yapılarını üç boyutlu olarak analiz edebilen tahribatsız bir araçtır. Mevcut protokol, parazitik bitki yapısını ve işlevini analiz etmek için mikro-BT'den yararlanmak için numune hazırlamayı açıklamaktadır. Belirli preparatlarla birleştirildiğinde bu yöntemin avantajlarını vurgulamak için farklı türler kullanılır.

Mikro-BT taraması, bitki yapısını ve işlevini araştırmada yerleşik bir araç haline gelmiştir. Tahribatsız doğası, üç boyutlu görselleştirme ve sanal bölümleme olasılığı ile birleştiğinde, karmaşık bitki organlarının yeni ve giderek daha ayrıntılı analizine izin vermiştir. Paraziter bitkiler ve konakçıları da dahil olmak üzere bitkiler arasındaki etkileşimler de araştırılabilir. Bununla birlikte, taramadan önce numune hazırlama, genellikle doku organizasyonu ve kompozisyonunda farklılık gösteren bu bitkiler arasındaki etkileşim nedeniyle çok önemli hale gelir. Ayrıca, parazitik çiçekli bitkilerin geniş çeşitliliği, oldukça azaltılmış bitkisel gövdelerden ağaçlara, bitkilere ve çalılara kadar, parazit konakçı materyalin örneklenmesi, işlenmesi ve hazırlanması sırasında dikkate alınmalıdır. Burada, haustoryumu analiz etmeye odaklanarak parazit ve / veya konakçı bitkilere kontrast çözeltileri sokmak için iki farklı yaklaşım açıklanmaktadır. Bu organ iki bitki arasındaki bağlantıyı ve iletişimi teşvik eder. Basit bir yaklaşımı takiben, haustorium doku organizasyonunun ayrıntıları, burada öfitoid, asma ve ökse otu parazitik türleri için gösterildiği gibi üç boyutlu olarak araştırılabilir. Spesifik zıt ajanların seçilmesi ve uygulama yaklaşımları, burada zorunlu bir kök parazit için gösterildiği gibi, konakçı vücutta endoparazit yayılımının ayrıntılı olarak gözlemlenmesine ve parazit ile konakçı arasındaki doğrudan damardan damara bağlantının tespit edilmesine de olanak tanır. Bu nedenle, burada tartışılan protokol, gelişimlerinin, yapılarının ve işlevlerinin anlaşılmasını ilerletmek için parazitik çiçekli bitkilerin geniş çeşitliliğine uygulanabilir.

Yüksek çözünürlüklü röntgen mikrobilgisayarlı tomografi (mikro-BT), bir numunenin çoklu radyografilerinin (projeksiyonlarının) farklı görüş açılarından kaydedildiği ve daha sonra numunenin sanal bir rekonstrüksiyonunu sağlamak için kullanıldığı bir görüntüleme yöntemidir1. Bu sanal nesne daha sonra analiz edilebilir, manipüle edilebilir ve bölümlere ayrılabilir, böylece üç boyutlu2'de tahribatsız keşif yapılabilir. Başlangıçta tıbbi analizler ve daha sonra endüstriyel uygulamalar için tasarlanan mikro-BT, invaziv prosedürlere gerek kalmadan iç organları ve dokuları görselleştirme avantajı da sunar3

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Paraziter bitki numune seçimi

  1. Ekli konakçı kök / kök ve parazitli konakçı organın hem proksimal hem de distal uçlarının segmentleri dahil olmak üzere tüm parazitik bitki haustoriumunu toplayın; Her segmentin ideal uzunluğu, haustoriumun çapının iki katına eşdeğerdir.
    NOT: Lateral haustoria için, haustoriumun oluştuğu parazit ana sapının/kökünün bir kısmını ekleyin (Şekil 1A,B,D). Endoparazitler için, parazit .......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Parazitik bitkilerin haustoriumu, konakçı olarak kullanılan başka bir bitkinin dokularıyla iç içe geçen ve bağlanan farklı doku ve hücre tiplerinden oluşan karmaşık bir organdır20. Mikro-BT taraması, hem küçük (Şekil 1A-C) hem de büyük (Şekil 1D, E) haustoria'yı analiz ederken bu karmaşık yapıyı tahribatsız ve üç boyutlu bir şekilde daha iyi anlamak i?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bitki dokusu kontrastını iyileştirmek için ağır metal çözeltilerinin kullanılması, mikro-BT analizi için numune hazırlamada çok önemli bir adım haline gelmiştir. Bitki mikromorfolojisi laboratuvarlarında yaygın olarak bulunan çeşitli bileşikler, fosfotungstatın nüfuz eden numunelerde ve kontrast indeksi8'in arttırılmasında en etkili ajan olarak kullanılmasını öneren Staedler ve ark. tarafından test edilmiştir. Burada P. pubera haustoriumunun analizinde elde.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dr. Simone Gomes Ferreira'ya (Mikrotomografi Laboratuvarı, Sao Paulo Üniversitesi, Brezilya) ve Dr. Greg Lin'e (Nano Ölçekli Sistemler Merkezi, Harvard Üniversitesi, ABD) farklı mikrotomografi sistemleri ve veri analiz yazılımları için üstün yardımları ve vazgeçilmez kullanıcı eğitimleri için teşekkür ederim. Ayrıca Connecticut Üniversitesi'ndeki (ABD) EEB Sera personeline, özellikle Clinton Morse ve Matthew Opel'e Viscum minimum örneklerini sağladıkları için teşekkür ediyorum. Dr. John Wenzel, Pyrularia pubera'nın örneklenmesi için fırsat ve büyük yardım sağladı. Carolina Bastos, Yasmin Hirao ve Talitha Motta, Scybalium fungiforme'un örnekl....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
3D X-ray microscope (XRM) systemZeiss Versa 620used to scan Pyrularia pubera
3D X-ray microscope + A2:D22ZeissVersa 620Used for scanning the species P. pubera
CT-Pro 3D softwareNikonversion XT 3.1.11Used for three-dimensional reconstruction of scans
CT-Vox softwareBrukerversion 3.3.1Used for analyses and acquisition of images and videos
Dragonfly softwareObject Research Systems - ORSversionUsed for analyses and acquisition of images and videos
Glass vialsGlass Vials Inc. SEV2708C-FM-SPSold by VWR - USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi
Inspect-XZeissversion XT 3.1.11Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system
Iodine solution 0.0282 NWR Chemicals BDHBDH7422-1Sold by VWR - USA
Lead Nitrate II PA 500 gVetec361.08Sold by SPLab
Microtomography scannerBrukerSkyscan1176Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme
Microtomography scannerNikonX-Tek HMXST225Used for scanning the species V. minimum
NRecon softwareBrukerversion 1.0.0Used for three-dimensional reconstruction
Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solutionElectron Microscopy Sciences101410-756Sold by VWR - USA
Plastic film (Parafilm)Heathrow ScientificPM996Sold by VWR - USA
Plastic IV bag 500 mLTaylor3478Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude
PVC tubing 3/4''Nalge Nunc InternationalSC63013-164Sold by VWR - USA
Scanning systemNikon X-Tek HMXST225used to scan Viscum minimum
Scanning systemBruker Skyscan 1176used to scan C. americana
Scout-and-ScanTM softwareZeissversion 16Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans
Three-way valveToToTDMTWVS-5Sold by Amazon USA
Two-part syringeHSW Henke-Ject4850001000Used without the plunger
Vacuum chamberBinder80080-434Sold by VWR - USA; includes pump and connecting tubes
VG Studio Max softwareVolume Graphicsversion 3.0Used for analyses and acquisition of images and videos

  1. Stock, S. R. . Microcomputed tomography: Methodology and applications. , (2020).
  2. Hounsfield, G. N. Computerized transverse axial scanning (tomography): I. Description of system. British Journal of Radiology. 46 (552), 1016-1022 (1973).
  3. Dutilleul, P., Lafond, J. A. Editorial: Branching and rooting out with a CT Scanner: The why, the how, and the outcomes, present and possibly future pierre. Frontiers in Plant Science. 7 (41), 5-6 (2016).
  4. Metscher, B. D. Biological applications of X-ray microtomography: Imaging micro- anatomy, molecular expression and organismal diversity. Microscopy and Analysis. 27 (2), 13-16 (2013).
  5. Sakdinawat, A., Attwood, D. Nanoscale X-ray imaging. Nature Photonics. 4 (12), 840-848 (2010).
  6. Walton, L. A., et al. Morphological characterisation of unstained and intact tissue micro-architecture by X-ray computed micro- and nano-tomography. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
  7. Lafond, J. A., Han, L., Dutilleul, P. Concepts and analyses in the ct scanning of root systems and leaf canopies: A timely summary. Frontiers in Plant Science. 6 (1111), 85-91 (2015).
  8. Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via X-Ray Tomography: Simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS ONE. 8 (9), 75295 (2013).
  9. Heeraman, D. A., Hopmans, J. W., Clausnitzer, V. Three dimensional imaging of plant roots in situ with X-ray Computed Tomography. Plant and Soil. 189, 167-179 (1997).
  10. Dhondt, S., Vanhaeren, H., Van Loo, D., Cnudde, V., Inzé, D. Plant structure visualization by high-resolution X-ray computed tomography. Trends in Plant Science. 15 (8), 419-422 (2010).
  11. McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162 (2013).
  12. Cochard, H., Delzon, S., Badel, E. X-ray microtomography (micro-CT): A reference technology for high-resolution quantification of xylem embolism in trees. Plant, Cell and Environment. 38 (1), 201-206 (2015).
  13. Bastos, C. L., Tamaio, N., Angyalossy, V. Unravelling roots of lianas: A case study in Sapindaceae. Annals of Botany. 118 (4), 733-746 (2016).
  14. da Cunha Neto, I. L., et al. Diversity, distribution, development, and evolution of medullary bundles in Nyctaginaceae. American Journal of Botany. 107 (5), 707-725 (2020).
  15. Milien, M., Renault-Spilmont, A. S., Cookson, S. J., Sarrazin, A., Verdeil, J. L. Visualization of the 3D structure of the graft union of grapevine using X-ray tomography. Scientia Horticulturae. 144, 130-140 (2012).
  16. Paya, A. M., Silverberg, J. L., Padgett, J., Bauerle, T. L. X-ray computed tomography uncovers root-root interactions: Quantifying spatial relationships between interacting root systems in three dimensions. Frontiers in Plant Science. 6 (274), 54-65 (2015).
  17. Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. C. T. Aligning microtomography analysis with traditional anatomy for a 3D understanding of the host-parasite interface - Phoradendron spp. Case study. Frontiers in Plant Science. 7, 1340 (2016).
  18. Lusic, H., Grinstaff, M. W. X-ray-computed tomography contrast agents. Chemical Reviews. 113 (3), 1641-1666 (2013).
  19. Těšitel, J. Functional biology of parasitic plants: a review. Plant Ecology and Evolution. 149 (1), 5-20 (2016).
  20. Teixeira-Costa, L. A living bridge between two enemies: Haustorium structure and evolution across parasitic flowering plants. Revista Brasileira de Botanica. 44 (1), 165-178 (2021).
  21. Kuijt, J. . The Biology of Parasitic Flowering Plants. , (1969).
  22. Masumoto, N., et al. Three-dimensional reconstructions of haustoria in two parasitic plant species in the Orobanchaceae. Plant Physiology. 185 (4), 1429-1442 (2021).
  23. Calo, C. M., et al. A correlation analysis of Light Microscopy and X-ray MicroCT imaging methods applied to archaeological plant remains' morphological attributes visualization. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
  24. Brodersen, C. R., Roddy, A. B. New frontiers in the three-dimensional visualization of plant structure and function. American Journal of Botany. 103 (2), 184-188 (2016).
  25. Teixeira-Costa, L., Davis, C. C. Life history, diversity, and distribution in parasitic flowering plants. Plant Physiology. 187 (1), 32-51 (2021).
  26. Simpson, B. B. Krameriaceae. Flora Neotropica Monograph. 49, (1989).
  27. Ruzin, S. E. . Plant microtechnique and microscopy. , (1999).
  28. Nikolov, L. A., Tomlinson, P. B., Manickam, S., Endress, P. K., Kramer, E. M., Davis, C. C. Holoparasitic Rafflesiaceae possess the most reduced endophytes and yet give rise to the world's largest flowers. Annals of Botany. 114, 233-242 (2014).
  29. Thorogood, C. J., Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G., Davis, C., Hiscock, S. J. Endoparasitic plants and fungi show evolutionary convergence across phylogenetic divisions. New Phytologist. 232 (3), 1159-1167 (2021).
  30. Largent, D., Johnson, D., Watling, R. . How to Identify Mushrooms to Genus III: Microscopic Features. , (1977).
  31. Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2293-2298 (2018).
  32. Sperry, J. S., Donnelly, J. R., Tyree, M. T. A method for measuring hydraulic conductivity and embolism in xylem. Plant, Cell and Environment. 11, 35-40 (1988).
  33. Calvin, C. L. Host-formed tyloses in vessels of the mistletoe Phoradendron (Viscaceae). IAWA Journal. 18 (2), 117-126 (1997).
  34. Teixeira-Costa, L., Ceccantini, G. Embolism increase and anatomical modifications caused by a parasitic plant. IAWA Journal. 36 (2), 138-151 (2015).
  35. Ellmore, G. S., Ewers, F. W. Fluid flow in the outermost xylem increment of a ring-porous tree, Ulmus americana. American Journal of Botany. 73 (12), 1771-1774 (1986).
  36. Ellis, E. A. Staining sectioned biological specimens for transmission electron microscopy: Conventional and En bloc stains. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117, 57-72 (2014).
  37. Brodersen, C. R., McElrone, A. J., Choat, B., Matthews, M. A., Shackel, K. A. The dynamics of embolism repair in xylem: In vivo visualizations using high-resolution computed tomography. Plant Physiology. 154 (3), 1088-1095 (2010).
  38. Brodersen, C. R., et al. Automated analysis of three-dimensional xylem networks using high-resolution computed tomography. New Phytologist. 191 (4), 1168-1179 (2011).
  39. Lee, K., et al. Visualizing plant development and gene expression in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18 (9), 2145-2156 (2006).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved