JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Biochemistry

حركية الجزيئات المفردة ومجموعات الكينيسين-5 Cin8 ثنائية الاتجاه المنقاة من خلايا S. cerevisiae

Published: February 2nd, 2022

DOI:

10.3791/63425

1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, Israel, 2Department of Biotechnology Engineering, Ben-Gurion University of the Negev, Israel

يتراكم الكينيسين-5 Cin8 الانقسامي ثنائي الاتجاه في مجموعات تنقسم وتندمج أثناء حركتها. التراكم في مجموعات يغير أيضا سرعة واتجاه Cin8. هنا ، يتم وصف بروتوكول لاختبارات الحركة مع Cin8-GFP المنقى وتحليل الخصائص المتحركة للجزيئات المفردة ومجموعات Cin8.

تؤدي محركات كينيسين -5 ثنائية القطب الانقسامية وظائف أساسية في ديناميكيات المغزل. تظهر هذه المحركات بنية متجانسة رباعية مع زوجين من مجالات المحركات الحفازة ، وتقع في طرفي نقيض من المجمع النشط. تمكن هذه البنية الفريدة محركات kinesin-5 من الربط والانزلاق بعيدا عن الأنابيب الدقيقة المغزل المضادة للتوازي (MTs) ، وبالتالي توفير القوة الموجهة ظاهريا التي تفصل بين قطبي المغزل عن بعضهما البعض. في السابق ، كان يعتقد أن محركات kinesin-5 موجهة حصريا بالإضافة إلى النهاية. ومع ذلك ، كشفت الدراسات الحديثة أن العديد من محركات كينيسين 5 الفطرية موجهة ناقص النهاية على مستوى الجزيء الواحد ويمكنها تغيير الاتجاه في ظل ظروف تجريبية مختلفة. يعد Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 مثالا على هذا البروتين الحركي ثنائي الاتجاه: في ظروف القوة الأيونية العالية ، تتحرك جزيئات واحدة من Cin8 في اتجاه نهاية MTs ناقص. وتبين أيضا أن Cin8 تشكل مجموعات متحركة، في الغالب في الطرف الناقص من MTs، ويسمح هذا التجمع ل Cin8 بتبديل الاتجاه والخضوع لحركية بطيئة زائدة موجهة. توفر هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لجميع خطوات العمل مع kinesin-5 Cin8 الموسوم ب GFP ، من الإفراط في التعبير عن البروتين في خلايا S. cerevisiae وتنقيته إلى فحص حركية جزيء واحد في المختبر . تساعد الطريقة المطورة حديثا الموصوفة هنا على التمييز بين الجزيئات المفردة ومجموعات Cin8 ، بناء على شدة التألق. تتيح هذه الطريقة تحليلا منفصلا لحركية الجزيئات المفردة ومجموعات Cin8 ، مما يوفر توصيف اعتماد حركية Cin8 على حجم عنقودها.

يتم توسط عدد كبير من أحداث الحركة داخل الخلايا حقيقية النواة من خلال وظيفة البروتينات الحركية الجزيئية. تتحرك هذه المحركات على طول خيوط الهيكل الخلوي ، وخيوط الأكتين ، والأنابيب الدقيقة (MTs) ، وتحول الطاقة الكيميائية للتحلل المائي ATP إلى قوى حركية وميكانيكية مطلوبة لدفع الحركة البيولوجية داخل الخلايا. S. cerevisiae Cin8 القائم على MT هو بروتين محرك كينيسين -5 ثنائي القطب ، متجانس ، يربط ويمرر MTs المغزل بعيداعن 1. يؤدي Cin8 وظائف أساسية أثناء الانقسام ، في تجميع المغزل2،3،4 واستطالة المغزل خلال الطور5،6

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. إعداد المخازن المؤقتة والكواشف

  1. المخازن المؤقته
    1. - مزيج تسرب Leu aa: امزج 2 جم من كل من الأدينين والوراسيل والتريبتوفان والهيستيدين والليسين والميثيونين وخزن في درجة حرارة الغرفة.
    2. وسط انتقائي للخميرة مع رافينوز (1 لتر): امزج 6.7 جم من قاعدة نيتروجين الخميرة (مع كبريتات ا.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تهدف التجربة إلى التحقيق في خصائص الحركة لبروتين المحرك ثنائي الاتجاه Cin8 بأحجام عنقودية مختلفة على MTs مفردة. الحركة التمثيلية ل Cin8-GFP واضحة أيضا من الكيموغراف في الشكل 5A ، حيث يتم عرض الموقع المكاني للمحرك بمرور الوقت.

لتحليل الخصائص المتحركة ل Cin8-GFP ، أولا ، ?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في هذا العمل ، يتم تقديم بروتوكول لفحص حركية جزيء واحد مع kinesin-5 Cin8 ثنائي الاتجاه وتحليل الحركة. تم تنقية Cin818 كامل الطول بما في ذلك إشارة التوطين النووي الأصلية (NLS) في المحطة C من المضيف الأصلي S. cerevisiae. نظرا لأن Cin8 هو بروتين محرك نووي ، فقد وجد أن طحن خلايا S. cerevisiae تحت الن.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تم دعم هذا البحث جزئيا من خلال منحة مؤسسة العلوم الإسرائيلية (ISF-386/18) ومنحة مؤسسة العلوم الإسرائيلية ثنائية القومية (BSF-2019008) ، الممنوحة ل L.G.

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
AdenineFORMEDIUMDOC0230
ATPSigmaA7699
Biotinylated-BSASigmaA8549
CaseinSigmaC7078
Catalase (C40)SigmaC40
Creatine-KinaseSigmaC3755
Dithiothreitol (DTT)SigmaD0632
EDTASigmaE5134
EGTASigmaE4378
Fluorescence filter set for GFPChroma49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)
Fluorescence filter set for RhodamineChroma49004: ET-CY3/TRITC
Fluorescence inverted microscopeZeissAxiovert 200M
GalactoseTivan BiotechGAL02
GlucoseSigmaG8270
Glucose OxidaseSigmaG7141
GlycerolSigmaG5516
GlycylGlycineMerckG0674
GMPCPPJana BioscienceNu-405L
GTBCytoskeletonBST01-010
GTPSigmaG8877
HistidineDuchefa BiochemieH0710.0100
ImageJ-FIJI softwarehttps://imagej.net/plugins/trackmate/version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10
ImidazoleSigmaI0125
InstantBlue Coomassie Protein StainAbcamab119211
LensZeiss100x/1.4 oil DIC objective
LysineFORMEDIUMDOC0161
Magnesium ChlorideSigmaM8266
MethionineDuchefa BiochemieM0715.0100
NeoAndor TechnologiessCMOS camera
NeutraAvidinLifeA2666
Ni-NTA AgaroseInvitrogenR901-15
Phospho-CreatineSigmaP1937
PipesSigmaP1851
Pluronic acid F-127 (poloxamer)SigmaP2443
Potassium ChlorideSigmaP9541
RaffinoseTivan BiotechRAF01
Size Exclusion chromatography instumentGE HealthcareAKTA Pure
SpectrophotometerThermoFisher ScientificNanoDrop
Superose-6 10/300 GLGE Healthcare17-5172-01
TrisRoshe10708976001
Triton X-100SigmaT8787
TryptophanDuchefa BiochemieT0720.0100
Tubulin proteinCytoskeletonT240
Tubulin, biotinylatedCytoskeletonT333P
Tubulin, TRITC RhodamineCytoskeletonTL530M
UracilSigmaU0750-100G
Yeast nitrogen baseFORMEDIUMCYN0401S
α-GFP antibodySanta Cruz BiotechnologySC8036
β-mercaptoethanolSigmaM3148

  1. Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).
  2. Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations. Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).
  3. Saunders, W. S., Hoyt, M. A. Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle. Cell. 70 (3), 451-458 (1992).
  4. Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly. Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).
  5. Gerson-Gurwitz, A., et al. Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).
  6. Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation. EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).
  7. Movshovich, N., et al. Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells. Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).
  8. Gerson-Gurwitz, A., et al. Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry. Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).
  9. Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
  10. Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis. Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).
  11. Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking. eLife. 10, 71036 (2021).
  12. Pandey, H., et al. Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis. Science Advances. 7 (6), 1687 (2021).
  13. Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420 (2021).
  14. Fridman, V., et al. Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo. Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).
  15. Edamatsu, M. Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7. Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).
  16. Popchock, A. R., et al. The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch. Nature Communications. 8, 13999 (2017).
  17. Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9 (9), 51131 (2020).
  18. Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).
  19. Pandey, H., et al. Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).
  20. Shapira, O., Gheber, L. Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain. Scientific Reports. 6, 25597 (2016).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Britto, M., et al. Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).
  23. Kapitein, L. C., et al. Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5. Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).
  24. Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1. Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).
  25. Katrukha, E. A., et al. Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots. Nature Communications. 8, 14772 (2017).
  26. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  27. Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis. eLife. 8, 42288 (2019).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved