Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biochemistry
Den tovejs mitotiske kinesin-5 Cin8 akkumuleres i klynger, der splittes og fusionerer under deres bevægelighed. Akkumulering i klynger ændrer også Cin8's hastighed og retningsvirkning. Her beskrives en protokol for motilitetsassays med oprenset Cin8-GFP og analyse af bevægelige egenskaber af enkeltmolekyler og klynger af Cin8.
De mitotiske bipolære kinesin-5 motorer udfører væsentlige funktioner i spindeldynamikken. Disse motorer udviser en homo-tetramere struktur med to par katalytiske motordomæner, der ligger i modsatte ender af det aktive kompleks. Denne unikke arkitektur gør det muligt for kinesin-5-motorer at tværbinde og glide fra hinanden antiparallelle spindelmikrotubuli (MT'er), hvilket giver den udadrettede kraft, der adskiller spindelpolerne fra hinanden. Tidligere blev kinesin-5 motorer antaget at være udelukkende plus-end rettet. Nylige undersøgelser afslørede imidlertid, at flere svampekinesin-5-motorer er minus-ende rettet mod enkeltmolekyleniveauet og kan skifte retningsbestemthed under forskellige eksperimentelle forhold. Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 er et eksempel på et sådant tovejs motorisk protein: Under betingelser med høj ionstyrke bevæger enkelte molekyler af Cin8 sig i minus-end retning af MT'erne. Det blev også vist, at Cin8 danner bevægelige klynger, overvejende i minus-enden af MT'erne, og en sådan klyngedannelse gør det muligt for Cin8 at skifte retningsbestemthed og gennemgå langsom, plus-end rettet bevægelighed. Denne artikel indeholder en detaljeret protokol for alle trin i arbejdet med GFP-mærket kinesin-5 Cin8, fra proteinoverekspression i S. cerevisiae-celler og dets oprensning til in vitro-enkeltmolekylemotilitetsassay . En nyudviklet metode beskrevet her hjælper med at skelne mellem enkeltmolekyler og klynger af Cin8 baseret på deres fluorescensintensitet. Denne metode muliggør separat analyse af bevægeligheden af enkeltmolekyler og klynger af Cin8, hvilket giver karakteriseringen af cin8-motilitetens afhængighed af dens klyngestørrelse.
Et stort antal motilitetshændelser i eukaryote celler medieres af funktionen af molekylære motoriske proteiner. Disse motorer bevæger sig langs cytoskeletale filamenter, actinfilamenter og mikrotubuli (MT'er) og omdanner den kemiske energi af ATP-hydrolyse til kinetiske og mekaniske kræfter, der kræves for at drive biologisk bevægelighed i celler. Den MT-baserede S. cerevisiae Cin8 er et bipolært, homotetramert kinesin-5 motorprotein, der tværbinder og glider spindel-MT'er fra hinanden1. Cin8 udfører væsentlige funktioner under mitose, i spindelsamling <....
1. Fremstilling af buffere og reagenser
Eksperimentet har til formål at undersøge motilitetsegenskaberne ved tovejsmotorisk protein Cin8 i forskellige klyngestørrelser på enkelte MT'er. Repræsentativ bevægelighed for Cin8-GFP fremgår også af kymograferne i figur 5A, hvor motorens rumlige position over tid er vist.
Til analyse af Cin8-GFP's bevægelige egenskaber tildeles først klyngestørrelsen (trin 4.3) til hver MT-vedhæftet bevægelig Cin8-GFP-partikel, og derefter spores positionen af de u.......
I dette arbejde præsenteres en protokol for enkeltmolekylemotilitetsassay med den tovejs kinesin-5 Cin8 og motilitetsanalysen. Cin818 i fuld længde inklusive det oprindelige nukleare lokaliseringssignal (NLS) ved C-terminalen er blevet renset fra den indfødte vært S. cerevisiae. Da Cin8 er et nukleart motorprotein, viser slibning af S. cerevisiae-cellerne under flydende nitrogen sig at være den mest effektive metode til cellelyse. Efter lysis opnås der ved at kombinere meta.......
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adenine | FORMEDIUM | DOC0230 | |
ATP | Sigma | A7699 | |
Biotinylated-BSA | Sigma | A8549 | |
Casein | Sigma | C7078 | |
Catalase (C40) | Sigma | C40 | |
Creatine-Kinase | Sigma | C3755 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
EDTA | Sigma | E5134 | |
EGTA | Sigma | E4378 | |
Fluorescence filter set for GFP | Chroma | 49002: ET-EGFP (FITC/Cy2) | |
Fluorescence filter set for Rhodamine | Chroma | 49004: ET-CY3/TRITC | |
Fluorescence inverted microscope | Zeiss | Axiovert 200M | |
Galactose | Tivan Biotech | GAL02 | |
Glucose | Sigma | G8270 | |
Glucose Oxidase | Sigma | G7141 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
GlycylGlycine | Merck | G0674 | |
GMPCPP | Jana Bioscience | Nu-405L | |
GTB | Cytoskeleton | BST01-010 | |
GTP | Sigma | G8877 | |
Histidine | Duchefa Biochemie | H0710.0100 | |
ImageJ-FIJI software | https://imagej.net/plugins/trackmate/ | version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10 | |
Imidazole | Sigma | I0125 | |
InstantBlue Coomassie Protein Stain | Abcam | ab119211 | |
Lens | Zeiss | 100x/1.4 oil DIC objective | |
Lysine | FORMEDIUM | DOC0161 | |
Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
Methionine | Duchefa Biochemie | M0715.0100 | |
Neo | Andor Technologies | sCMOS camera | |
NeutraAvidin | Life | A2666 | |
Ni-NTA Agarose | Invitrogen | R901-15 | |
Phospho-Creatine | Sigma | P1937 | |
Pipes | Sigma | P1851 | |
Pluronic acid F-127 (poloxamer) | Sigma | P2443 | |
Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
Raffinose | Tivan Biotech | RAF01 | |
Size Exclusion chromatography instument | GE Healthcare | AKTA Pure | |
Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | NanoDrop | |
Superose-6 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
Tris | Roshe | 10708976001 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Tryptophan | Duchefa Biochemie | T0720.0100 | |
Tubulin protein | Cytoskeleton | T240 | |
Tubulin, biotinylated | Cytoskeleton | T333P | |
Tubulin, TRITC Rhodamine | Cytoskeleton | TL530M | |
Uracil | Sigma | U0750-100G | |
Yeast nitrogen base | FORMEDIUM | CYN0401S | |
α-GFP antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC8036 | |
β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved