JoVE Logo
Faculty Resource Center

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Biochemistry

Motilitet af enkeltmolekyler og klynger af tovejs kinesin-5 Cin8 renset fra S. cerevisiae-celler

Published: February 2nd, 2022

DOI:

10.3791/63425

1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, Israel, 2Department of Biotechnology Engineering, Ben-Gurion University of the Negev, Israel

Den tovejs mitotiske kinesin-5 Cin8 akkumuleres i klynger, der splittes og fusionerer under deres bevægelighed. Akkumulering i klynger ændrer også Cin8's hastighed og retningsvirkning. Her beskrives en protokol for motilitetsassays med oprenset Cin8-GFP og analyse af bevægelige egenskaber af enkeltmolekyler og klynger af Cin8.

De mitotiske bipolære kinesin-5 motorer udfører væsentlige funktioner i spindeldynamikken. Disse motorer udviser en homo-tetramere struktur med to par katalytiske motordomæner, der ligger i modsatte ender af det aktive kompleks. Denne unikke arkitektur gør det muligt for kinesin-5-motorer at tværbinde og glide fra hinanden antiparallelle spindelmikrotubuli (MT'er), hvilket giver den udadrettede kraft, der adskiller spindelpolerne fra hinanden. Tidligere blev kinesin-5 motorer antaget at være udelukkende plus-end rettet. Nylige undersøgelser afslørede imidlertid, at flere svampekinesin-5-motorer er minus-ende rettet mod enkeltmolekyleniveauet og kan skifte retningsbestemthed under forskellige eksperimentelle forhold. Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 er et eksempel på et sådant tovejs motorisk protein: Under betingelser med høj ionstyrke bevæger enkelte molekyler af Cin8 sig i minus-end retning af MT'erne. Det blev også vist, at Cin8 danner bevægelige klynger, overvejende i minus-enden af MT'erne, og en sådan klyngedannelse gør det muligt for Cin8 at skifte retningsbestemthed og gennemgå langsom, plus-end rettet bevægelighed. Denne artikel indeholder en detaljeret protokol for alle trin i arbejdet med GFP-mærket kinesin-5 Cin8, fra proteinoverekspression i S. cerevisiae-celler og dets oprensning til in vitro-enkeltmolekylemotilitetsassay . En nyudviklet metode beskrevet her hjælper med at skelne mellem enkeltmolekyler og klynger af Cin8 baseret på deres fluorescensintensitet. Denne metode muliggør separat analyse af bevægeligheden af enkeltmolekyler og klynger af Cin8, hvilket giver karakteriseringen af cin8-motilitetens afhængighed af dens klyngestørrelse.

Et stort antal motilitetshændelser i eukaryote celler medieres af funktionen af molekylære motoriske proteiner. Disse motorer bevæger sig langs cytoskeletale filamenter, actinfilamenter og mikrotubuli (MT'er) og omdanner den kemiske energi af ATP-hydrolyse til kinetiske og mekaniske kræfter, der kræves for at drive biologisk bevægelighed i celler. Den MT-baserede S. cerevisiae Cin8 er et bipolært, homotetramert kinesin-5 motorprotein, der tværbinder og glider spindel-MT'er fra hinanden1. Cin8 udfører væsentlige funktioner under mitose, i spindelsamling <....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Fremstilling af buffere og reagenser

  1. Buffere
    1. -Leu aa dropout mix: Bland 2 g hver af Adenin, Uracil, Tryptophan, Histidin, Lysin og Methionin og opbevar ved stuetemperatur.
    2. Gærselektivt medium med raffinose (1 l): Bland 6,7 g gærkvælstofbase (med ammoniumsulfat), 2 g -Leu aa-dropoutblanding og 20 g raffinose i dobbeltdestilleret vand under omrøring (uden opvarmning), indtil det er helt opløst. Brug et 0,22 μm filter til at filtrere opløsningen i en steril flaske.

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Eksperimentet har til formål at undersøge motilitetsegenskaberne ved tovejsmotorisk protein Cin8 i forskellige klyngestørrelser på enkelte MT'er. Repræsentativ bevægelighed for Cin8-GFP fremgår også af kymograferne i figur 5A, hvor motorens rumlige position over tid er vist.

Til analyse af Cin8-GFP's bevægelige egenskaber tildeles først klyngestørrelsen (trin 4.3) til hver MT-vedhæftet bevægelig Cin8-GFP-partikel, og derefter spores positionen af de u.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I dette arbejde præsenteres en protokol for enkeltmolekylemotilitetsassay med den tovejs kinesin-5 Cin8 og motilitetsanalysen. Cin818 i fuld længde inklusive det oprindelige nukleare lokaliseringssignal (NLS) ved C-terminalen er blevet renset fra den indfødte vært S. cerevisiae. Da Cin8 er et nukleart motorprotein, viser slibning af S. cerevisiae-cellerne under flydende nitrogen sig at være den mest effektive metode til cellelyse. Efter lysis opnås der ved at kombinere meta.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne forskning blev delvist støttet af Israel Science Foundation-bevillingen (ISF-386/18) og Israel Binational Science Foundation-bevillingen (BSF-2019008), der blev tildelt L.G.

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
AdenineFORMEDIUMDOC0230
ATPSigmaA7699
Biotinylated-BSASigmaA8549
CaseinSigmaC7078
Catalase (C40)SigmaC40
Creatine-KinaseSigmaC3755
Dithiothreitol (DTT)SigmaD0632
EDTASigmaE5134
EGTASigmaE4378
Fluorescence filter set for GFPChroma49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)
Fluorescence filter set for RhodamineChroma49004: ET-CY3/TRITC
Fluorescence inverted microscopeZeissAxiovert 200M
GalactoseTivan BiotechGAL02
GlucoseSigmaG8270
Glucose OxidaseSigmaG7141
GlycerolSigmaG5516
GlycylGlycineMerckG0674
GMPCPPJana BioscienceNu-405L
GTBCytoskeletonBST01-010
GTPSigmaG8877
HistidineDuchefa BiochemieH0710.0100
ImageJ-FIJI softwarehttps://imagej.net/plugins/trackmate/version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10
ImidazoleSigmaI0125
InstantBlue Coomassie Protein StainAbcamab119211
LensZeiss100x/1.4 oil DIC objective
LysineFORMEDIUMDOC0161
Magnesium ChlorideSigmaM8266
MethionineDuchefa BiochemieM0715.0100
NeoAndor TechnologiessCMOS camera
NeutraAvidinLifeA2666
Ni-NTA AgaroseInvitrogenR901-15
Phospho-CreatineSigmaP1937
PipesSigmaP1851
Pluronic acid F-127 (poloxamer)SigmaP2443
Potassium ChlorideSigmaP9541
RaffinoseTivan BiotechRAF01
Size Exclusion chromatography instumentGE HealthcareAKTA Pure
SpectrophotometerThermoFisher ScientificNanoDrop
Superose-6 10/300 GLGE Healthcare17-5172-01
TrisRoshe10708976001
Triton X-100SigmaT8787
TryptophanDuchefa BiochemieT0720.0100
Tubulin proteinCytoskeletonT240
Tubulin, biotinylatedCytoskeletonT333P
Tubulin, TRITC RhodamineCytoskeletonTL530M
UracilSigmaU0750-100G
Yeast nitrogen baseFORMEDIUMCYN0401S
α-GFP antibodySanta Cruz BiotechnologySC8036
β-mercaptoethanolSigmaM3148

  1. Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).
  2. Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations. Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).
  3. Saunders, W. S., Hoyt, M. A. Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle. Cell. 70 (3), 451-458 (1992).
  4. Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly. Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).
  5. Gerson-Gurwitz, A., et al. Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).
  6. Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation. EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).
  7. Movshovich, N., et al. Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells. Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).
  8. Gerson-Gurwitz, A., et al. Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry. Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).
  9. Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
  10. Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis. Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).
  11. Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking. eLife. 10, 71036 (2021).
  12. Pandey, H., et al. Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis. Science Advances. 7 (6), 1687 (2021).
  13. Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420 (2021).
  14. Fridman, V., et al. Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo. Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).
  15. Edamatsu, M. Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7. Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).
  16. Popchock, A. R., et al. The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch. Nature Communications. 8, 13999 (2017).
  17. Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9 (9), 51131 (2020).
  18. Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).
  19. Pandey, H., et al. Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).
  20. Shapira, O., Gheber, L. Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain. Scientific Reports. 6, 25597 (2016).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Britto, M., et al. Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).
  23. Kapitein, L. C., et al. Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5. Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).
  24. Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1. Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).
  25. Katrukha, E. A., et al. Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots. Nature Communications. 8, 14772 (2017).
  26. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  27. Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis. eLife. 8, 42288 (2019).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved