Beweeglijkheid van enkele moleculen en clusters van bidirectionele kinesine-5 Cin8 gezuiverd uit S. cerevisiae-cellen

De bidirectionele mitotische kinesine-5 Cin8 hoopt zich op in clusters die splitsen en samensmelten tijdens hun beweeglijkheid. Accumulatie in clusters verandert ook de snelheid en directionaliteit van Cin8. Hier wordt een protocol voor motiliteitstests met gezuiverde Cin8-GFP en analyse van beweeglijke eigenschappen van afzonderlijke moleculen en clusters van Cin8 beschreven.

De mitotische bipolaire kinesine-5 motoren vervullen essentiële functies in de spindeldynamica. Deze motoren vertonen een homo-tetramere structuur met twee paar katalytische motordomeinen, gelegen aan tegenovergestelde uiteinden van het actieve complex. Deze unieke architectuur stelt kinesine-5-motoren in staat om antiparallel spindelmicrotubuli (MT's) te kruisen en uit elkaar te schuiven, waardoor de naar buiten gerichte kracht wordt geleverd die de spindelpolen uit elkaar scheidt. Voorheen werd aangenomen dat kinesine-5-motoren uitsluitend plus-end gericht waren. Recente studies toonden echter aan dat verschillende schimmelkinesisine-5-motoren minus-end gericht zijn op het niveau van één molecuul en onder verschillende experimentele omstandigheden van directionaliteit kunnen veranderen. De Saccharomyces cerevisiae kinesine-5 Cin8 is een voorbeeld van een dergelijk bidirectioneel motoreiwit: in omstandigheden met hoge ionische sterkte bewegen enkele moleculen van Cin8 in de minus-eindrichting van de MT's. Er werd ook aangetoond dat Cin8 beweeglijke clusters vormt, voornamelijk aan het min-einde van de MT's, en een dergelijke clustering stelt Cin8 in staat om van directionaliteit te veranderen en langzame, plus-end gerichte motiliteit te ondergaan. Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol voor alle stappen van het werken met GFP-gelabelde kinesine-5 Cin8, van eiwitoverexpressie in S. cerevisiae-cellen en de zuivering ervan tot in vitro motiliteitstest met één molecuul. Een nieuw ontwikkelde methode die hier wordt beschreven, helpt onderscheid te maken tussen afzonderlijke moleculen en clusters van Cin8, op basis van hun fluorescentie-intensiteit. Deze methode maakt een afzonderlijke analyse van de beweeglijkheid van afzonderlijke moleculen en clusters van Cin8 mogelijk, waardoor de afhankelijkheid van Cin8-motiliteit van de clustergrootte wordt gekarakteriseerd.

Een groot aantal motiliteitsgebeurtenissen in eukaryote cellen worden gemedieerd door de functie van moleculaire motoreiwitten. Deze motoren bewegen langs de cytoskeletale filamenten, actinefilamenten en microtubuli (MT's) en zetten de chemische energie van ATP-hydrolyse om in kinetische en mechanische krachten die nodig zijn om de biologische beweeglijkheid in cellen te stimuleren. De op MT gebaseerde S. cerevisiae Cin8 is een bipolair, homotetrameer kinesine-5 motoreiwit dat spindel-MT's uit elkaar schuift¹. Cin8 vervult essentiële functies tijdens mitose, in spindelassemblage ^2,3,....

1. Bereiding van buffers en reagentia

1. Buffers
   1. -Leu aa dropout mix: Meng 2 g elk van Adenine, Uracil, Tryptofaan, Histidine, Lysine en Methionine en bewaar bij kamertemperatuur.
   2. Gistselectief medium met raffinose (1 L): Meng 6,7 g giststikstofbasis (met ammoniumsulfaat), 2 g -Leu aa dropout-mix en 20 g raffinose in dubbel gedestilleerd water door roeren (zonder verhitting) totdat het volledig is opgelost. Filtreer de oplossing met een filter van 0,22 μm in een steriele fles.<.......

Het experiment heeft tot doel de beweeglijkheidskenmerken van bidirectioneel motoreiwit Cin8 van verschillende clustergroottes op enkele MT's te onderzoeken. Representatieve beweeglijkheid van Cin8-GFP blijkt ook uit de kymografen in figuur 5A, waar de ruimtelijke positie van de motor in de loop van de tijd wordt getoond.

Voor de analyse van de beweeglijke eigenschappen van Cin8-GFP wordt eerst de clustergrootte toegewezen (stap 4.3) aan elk MT-bevestigd beweeglij.......

In dit werk wordt een protocol voor single-molecule motiliteitstest met de bidirectionele kinesine-5 Cin8 en de motiliteitsanalyse gepresenteerd. De full-length Cin8¹⁸ inclusief het native nuclear localization signal (NLS) op de C-terminal is gezuiverd van de native host S. cerevisiae. Omdat de Cin8 een nucleair motoreiwit is, blijkt het malen van de S. cerevisiae-cellen onder vloeibare stikstof de meest efficiënte methode voor cellysis te zijn. Na lysis, door metaalaffiniteit e.......

Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door de Israel Science Foundation-beurs (ISF-386/18) en de Israel Binational Science Foundation-beurs (BSF-2019008), toegekend aan L.G.