Motilité de molécules uniques et d’amas de kinésine-5 Cin8 bidirectionnelle purifiée à partir de cellules de S. cerevisiae

La kinésine mitotique bidirectionnelle-5 Cin8 s’accumule en grappes qui se divisent et fusionnent au cours de leur motilité. L’accumulation en amas modifie également la vitesse et la directionnalité de Cin8. Ici, un protocole pour les tests de motilité avec Cin8-GFP purifié et l’analyse des propriétés mobiles de molécules uniques et de grappes de Cin8 est décrit.

Les moteurs bipolaires mitotiques kinésine-5 remplissent des fonctions essentielles dans la dynamique de la broche. Ces moteurs présentent une structure homo-tétramérique avec deux paires de domaines moteurs catalytiques, situés aux extrémités opposées du complexe actif. Cette architecture unique permet aux moteurs kinésine-5 de se réticuler et de séparer les microtubules de broche antiparallèles (MT), fournissant ainsi la force dirigée vers l’extérieur qui sépare les pôles de broche. Auparavant, on croyait que les moteurs kinésine-5 étaient exclusivement dirigés vers des extrémités plus. Cependant, des études récentes ont révélé que plusieurs moteurs fongiques à kinésine 5 sont dirigés vers l’extrémité négative au niveau de la molécule unique et peuvent changer de directionnalité dans diverses conditions expérimentales. La Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 est un exemple d’une telle protéine motrice bidirectionnelle: dans des conditions de force ionique élevée, des molécules uniques de Cin8 se déplacent dans la direction de l’extrémité négative des MT. Il a également été démontré que Cin8 forme des amas mobiles, principalement à l’extrémité inférieure des MT, et un tel regroupement permet à Cin8 de changer de directionnalité et de subir une motilité dirigée lente et plus- Cet article fournit un protocole détaillé pour toutes les étapes du travail avec la kinésine-5 Cin8 marquée GFP, de la surexpression des protéines dans les cellules de S. cerevisiae et de sa purification au test de motilité in vitro à molécule unique. Une méthode nouvellement développée décrite ici aide à différencier les molécules uniques et les amas de Cin8, en fonction de leur intensité de fluorescence. Cette méthode permet une analyse séparée de la motilité des molécules individuelles et des amas de Cin8, fournissant ainsi la caractérisation de la dépendance de la motilité de Cin8 sur sa taille de cluster.

Un grand nombre d’événements de motilité dans les cellules eucaryotes sont médiés par la fonction des protéines motrices moléculaires. Ces moteurs se déplacent le long des filaments cytosquelettiques, des filaments d’actine et des microtubules (MT), et convertissent l’énergie chimique de l’hydrolyse de l’ATP en forces cinétiques et mécaniques nécessaires pour conduire la motilité biologique dans les cellules. Le S. cerevisiae Cin8 à base de MT est une protéine motrice bipolaire homotétramérique de la kinésine-5 qui réticule et sépare les MT du fuseau¹. Cin8 remplit des fonctions essentielles pendant la mitose, dans l’assemblage de la b....

1. Préparation des tampons et des réactifs

1. Tampons
   1. -Leu aa dropout mix: Mélanger 2 g chacun d’adénine, d’uracile, de tryptophane, d’histidine, de lysine et de méthionine et conserver à température ambiante.
   2. Milieu sélectif de levure avec raffinose (1 L) : Mélanger 6,7 g de base d’azote de levure (avec du sulfate d’ammonium), 2 g de mélange de gouttes -Leu aa et 20 g de raffinose dans de l’eau double distillée en remuant (sans chauffage) jusqu’à disso.......

L’expérience vise à étudier les caractéristiques de motilité de la protéine motrice bidirectionnelle Cin8 de différentes tailles de grappes sur des MT uniques. La motilité représentative de Cin8-GFP est également évidente à partir des kymographes de la figure 5A, où la position spatiale du moteur au fil du temps est montrée.

Pour l’analyse des propriétés mobiles de Cin8-GFP, la taille du cluster est d’abord attribuée (étape 4.3) à chaque p.......

Dans ce travail, un protocole pour le test de motilité à molécule unique avec la kinésine bidirectionnelle-5 Cin8 et l’analyse de motilité sont présentés. Le Cin8¹⁸ pleine longueur, y compris le signal de localisation nucléaire natif (NLS) au terminal C, a été purifié à partir de l’hôte natif S. cerevisiae. Comme le Cin8 est une protéine du moteur nucléaire, le broyage des cellules de S. cerevisiae sous azote liquide s’avère être la méthode la plus efficac.......

Cette recherche a été soutenue en partie par la subvention de la Fondation israélienne pour la science (ISF-386/18) et la subvention de la Fondation binationale pour la science d’Israël (BSF-2019008), attribuée à L.G.