Motilität einzelner Moleküle und Cluster von bidirektionalem Kinesin-5 Cin8, gereinigt aus S. cerevisiae-Zellen

Das bidirektionale mitotische Kinesin-5 Cin8 sammelt sich in Clustern an, die sich während ihrer Motilität teilen und verschmelzen. Die Akkumulation in Clustern verändert auch die Geschwindigkeit und Richtungsabhängigkeit von Cin8. Hier wird ein Protokoll für Motilitätsassays mit gereinigtem Cin8-GFP und die Analyse der beweglichen Eigenschaften einzelner Moleküle und Cluster von Cin8 beschrieben.

Die mitotischen bipolaren Kinesin-5-Motoren erfüllen wesentliche Funktionen in der Spindeldynamik. Diese Motoren weisen eine homotetramere Struktur mit zwei Paaren katalytischer motorischer Domänen auf, die sich an gegenüberliegenden Enden des aktiven Komplexes befinden. Diese einzigartige Architektur ermöglicht es Kinesin-5-Motoren, antiparallele Spindelmikrotubuli (MTs) zu vernetzen und auseinander zu schieben und so die nach außen gerichtete Kraft bereitzustellen, die die Spindelpole voneinander trennt. Früher wurde angenommen, dass Kinesin-5-Motoren ausschließlich Plus-End-gesteuert sind. Neuere Studien zeigten jedoch, dass mehrere pilzliche Kinesin-5-Motoren am Minus-Ende auf die Einzelmolekülebene gerichtet sind und die Direktionalität unter verschiedenen experimentellen Bedingungen umschalten können. Das Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 ist ein Beispiel für ein solches bidirektionales Motorprotein: Unter Bedingungen mit hoher Ionenstärke bewegen sich einzelne Moleküle von Cin8 in Minus-End-Richtung der MTs. Es wurde auch gezeigt, dass Cin8 bewegliche Cluster bildet, hauptsächlich am Minus-Ende der MTs, und ein solches Clustering ermöglicht es Cin8, die Direktionalität zu wechseln und eine langsame, plus gerichtete Motilität zu durchlaufen. Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll für alle Schritte der Arbeit mit GFP-getaggtem Kinesin-5 Cin8, von der Proteinüberexpression in S. cerevisiae-Zellen über ihre Aufreinigung bis hin zum In-vitro-Einzelmolekül-Motilitätsassay . Eine hier beschriebene neu entwickelte Methode hilft, einzelne Moleküle und Cluster von Cin8 anhand ihrer Fluoreszenzintensität zu unterscheiden. Diese Methode ermöglicht eine separate Analyse der Motilität einzelner Moleküle und Cluster von Cin8 und liefert so die Charakterisierung der Abhängigkeit der Cin8-Motilität von ihrer Clustergröße.

Eine große Anzahl von Motilitätsereignissen in eukaryotischen Zellen wird durch die Funktion molekularer Motorproteine vermittelt. Diese Motoren bewegen sich entlang der zytoskelettalen Filamente, Aktinfilamente und Mikrotubuli (MTs) und wandeln die chemische Energie der ATP-Hydrolyse in kinetische und mechanische Kräfte um, die erforderlich sind, um die biologische Motilität in Zellen anzutreiben. Das MT-basierte S. cerevisiae Cin8 ist ein bipolares, homotetrameres Kinesin-5-Motorprotein, das Spindel-MTs vernetzt und auseinanderschiebt¹. Cin8 erfüllt wesentliche Funktionen während der Mitose, bei der Spindelmontage^....

1. Herstellung von Puffern und Reagenzien

1. Puffer
   1. -Leu aa Dropout-Mix: Je 2 g Adenin, Uracil, Tryptophan, Histidin, Lysin und Methionin mischen und bei Raumtemperatur lagern.
   2. Hefeselektives Medium mit Raffinose (1 L): 6,7 g Hefestickstoffbasis (mit Ammoniumsulfat), 2 g -Leu-aa-Tropfenmischung und 20 g Raffinose in doppelt destilliertem Wasser unter Rühren (ohne Erhitzen) mischen, bis sie vollständig aufgelöst sind. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,22-μm-Filter in eine s.......

Das Experiment zielt darauf ab, die Motilitätseigenschaften des bidirektionalen Motorproteins Cin8 verschiedener Clustergrößen auf einzelnen MTs zu untersuchen. Die repräsentative Motilität von Cin8-GFP ist auch aus den Kymographen in Abbildung 5A ersichtlich, wo die räumliche Position des Motors im Laufe der Zeit gezeigt wird.

Für die Analyse der beweglichen Eigenschaften von Cin8-GFP wird zunächst jedem MT-gebundenen beweglichen Cin8-GFP-Partikel die Clu.......

In dieser Arbeit wird ein Protokoll für den Einzelmolekül-Motilitätsassay mit dem bidirektionalen Kinesin-5 Cin8 und die Motilitätsanalyse vorgestellt. Das Cin8¹⁸ in voller Länge einschließlich des nativen nuklearen Lokalisierungssignals (NLS) am C-Terminal wurde vom nativen Wirt S. cerevisiae gereinigt. Da das Cin8 ein Kernmotorprotein ist, erweist sich das Mahlen der S. cerevisiae-Zellen unter flüssigem Stickstoff als die effizienteste Methode für die Zelllyse. Nach der.......

Diese Forschung wurde zum Teil durch das Stipendium der Israel Science Foundation (ISF-386/18) und das Stipendium der Israel Binational Science Foundation (BSF-2019008) unterstützt, das an L.G.