JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Biochemistry

תנועתיות של מולקולות בודדות ואשכולות של קינסין-5 Cin8 דו-כיווני מטוהרים מתאי S. cerevisiae

Published: February 2nd, 2022

DOI:

10.3791/63425

1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, Israel, 2Department of Biotechnology Engineering, Ben-Gurion University of the Negev, Israel

קינסין-5 Cin8 המיטוטי הדו-כיווני מצטבר באשכולות המתפצלים ומתמזגים במהלך תנועתיותם. הצטברות באשכולות משנה גם את המהירות והכיווניות של Cin8. כאן מתואר פרוטוקול לבדיקות תנועתיות עם Cin8-GFP מטוהר וניתוח תכונות תנועתיות של מולקולות בודדות ואשכולות של Cin8.

מנועי הקינזין-5 הדו-קוטביים המיטוטיים מבצעים פונקציות חיוניות בדינמיקת הציר. מנועים אלה מציגים מבנה הומו-טטרמרי עם שני זוגות של תחומים מוטוריים קטליטיים, הממוקמים בקצוות מנוגדים של המתחם הפעיל. ארכיטקטורה ייחודית זו מאפשרת למנועי kinesin-5 להצליב ולהחליק זה מזה מיקרוטובולים של צירים אנטי-פאראליים (MTs), ובכך לספק את הכוח המכוון כלפי חוץ המפריד בין מוטות הציר. בעבר, מנועי kinesin-5 האמינו להיות באופן בלעדי פלוס-סוף מכוון. עם זאת, מחקרים אחרונים גילו כי מספר מנועי קינזין-5 פטרייתיים מכוונים מינוס-קצה ברמת המולקולה הבודדת ויכולים לשנות כיוון בתנאי ניסוי שונים. Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 הוא דוגמה לחלבון מוטורי דו-כיווני כזה: בתנאי חוזק יוני גבוהים מולקולות בודדות של Cin8 נעות בכיוון המינוס-קצה של ה-MTs. כמו כן, הודגם כי Cin8 יוצר אשכולות תנועתיים, בעיקר בקצה המינוס של ה-MTs, ואשכולות כאלה מאפשרים ל-Cin8 לשנות כיוון ולעבור תנועתיות מכוונת איטית, בתוספת קצה. מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט לכל שלבי העבודה עם kinesin-5 Cin8 המתויג על-ידי GFP, החל מביטוי יתר של חלבונים בתאי S. cerevisiae וטיהורו ועד לבדיקת תנועתיות של מולקולה אחת במבחנה . שיטה חדשה שפותחה כאן מסייעת להבדיל בין מולקולות בודדות לאשכולות של Cin8, בהתבסס על עוצמת הפלואורסצנציה שלהם. שיטה זו מאפשרת ניתוח נפרד של תנועתיות של מולקולות בודדות ואשכולות של Cin8, ובכך מספקת את אפיון התלות של תנועתיות Cin8 בגודל האשכול שלו.

מספר רב של אירועי תנועתיות בתוך תאים אאוקריוטים מתווכים על ידי תפקודם של חלבונים מוטוריים מולקולריים. מנועים אלה נעים לאורך חוטי השלד הציטוסקטליים, חוטי האקטין והמיקרוטובולים (MTs), וממירים את האנרגיה הכימית של הידרוליזה של ATP לכוחות קינטיים ומכניים הנדרשים להנעת תנועתיות ביולוגית בתוך התאים. S. cerevisiae Cin8 מבוסס MT הוא חלבון מוטורי דו-קוטבי, הומו-טרמרי קינזין-5, אשר מצליב ומחליק MTs צירים זה מזה1. Cin8 מבצע פונקציות חיוניות במהלך מיטוזה, בהרכבת ציר 2,3,4 והתארכות ציר במהלךאנפאזה 5,6,7<....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. הכנת מאגרים וריאגנטים

  1. מאגרי
    1. -תערובת נשירה של Leu aa: מערבבים 2 גרם כל אחד של אדנין, אורצ'יל, טריפטופן, היסטידין, ליזין ומתיונין ומאחסנים בטמפרטורת החדר.
    2. מדיום סלקטיבי של שמרים עם ראפינוז (1 ליטר): מערבבים 6.7 גרם של בסיס חנקן שמרים (עם אמוניום גופרתי), 2 גרם של תערובת נשירה.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מטרת הניסוי היא לחקור את מאפייני התנועתיות של החלבון המוטורי הדו-כיווני Cin8 בגדלים שונים של צבירים ב-MTs בודדים. תנועתיות מייצגת של Cin8-GFP ניכרת גם מהקימוגרפים באיור 5A, שם מוצג המיקום המרחבי של המנוע לאורך זמן.

לצורך ניתוח תכונות תנועתיות של Cin8-GFP, ראשית, גודל הצב?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בעבודה זו מוצג פרוטוקול לבדיקת תנועתיות של מולקולה בודדת עם קינזין-5 Cin8 דו-כיווני וניתוח תנועתיות. ה-Cin818 באורך מלא, כולל אות הלוקליזציה הגרעינית המקומי (NLS) במסוף C טוהר מהמארח המקומי S. cerevisiae. מכיוון שה-Cin8 הוא חלבון מוטורי גרעיני, שחיקה של תאי S. cerevisiae תחת חנקן נוזלי נמצא.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענק הקרן הישראלית למדע (ISF-386/18) ומענק הקרן הלאומית למדע (BSF-2019008), שהוענק ל- L.G.

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
AdenineFORMEDIUMDOC0230
ATPSigmaA7699
Biotinylated-BSASigmaA8549
CaseinSigmaC7078
Catalase (C40)SigmaC40
Creatine-KinaseSigmaC3755
Dithiothreitol (DTT)SigmaD0632
EDTASigmaE5134
EGTASigmaE4378
Fluorescence filter set for GFPChroma49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)
Fluorescence filter set for RhodamineChroma49004: ET-CY3/TRITC
Fluorescence inverted microscopeZeissAxiovert 200M
GalactoseTivan BiotechGAL02
GlucoseSigmaG8270
Glucose OxidaseSigmaG7141
GlycerolSigmaG5516
GlycylGlycineMerckG0674
GMPCPPJana BioscienceNu-405L
GTBCytoskeletonBST01-010
GTPSigmaG8877
HistidineDuchefa BiochemieH0710.0100
ImageJ-FIJI softwarehttps://imagej.net/plugins/trackmate/version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10
ImidazoleSigmaI0125
InstantBlue Coomassie Protein StainAbcamab119211
LensZeiss100x/1.4 oil DIC objective
LysineFORMEDIUMDOC0161
Magnesium ChlorideSigmaM8266
MethionineDuchefa BiochemieM0715.0100
NeoAndor TechnologiessCMOS camera
NeutraAvidinLifeA2666
Ni-NTA AgaroseInvitrogenR901-15
Phospho-CreatineSigmaP1937
PipesSigmaP1851
Pluronic acid F-127 (poloxamer)SigmaP2443
Potassium ChlorideSigmaP9541
RaffinoseTivan BiotechRAF01
Size Exclusion chromatography instumentGE HealthcareAKTA Pure
SpectrophotometerThermoFisher ScientificNanoDrop
Superose-6 10/300 GLGE Healthcare17-5172-01
TrisRoshe10708976001
Triton X-100SigmaT8787
TryptophanDuchefa BiochemieT0720.0100
Tubulin proteinCytoskeletonT240
Tubulin, biotinylatedCytoskeletonT333P
Tubulin, TRITC RhodamineCytoskeletonTL530M
UracilSigmaU0750-100G
Yeast nitrogen baseFORMEDIUMCYN0401S
α-GFP antibodySanta Cruz BiotechnologySC8036
β-mercaptoethanolSigmaM3148

  1. Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).
  2. Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations. Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).
  3. Saunders, W. S., Hoyt, M. A. Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle. Cell. 70 (3), 451-458 (1992).
  4. Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly. Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).
  5. Gerson-Gurwitz, A., et al. Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).
  6. Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation. EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).
  7. Movshovich, N., et al. Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells. Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).
  8. Gerson-Gurwitz, A., et al. Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry. Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).
  9. Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
  10. Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis. Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).
  11. Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking. eLife. 10, 71036 (2021).
  12. Pandey, H., et al. Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis. Science Advances. 7 (6), 1687 (2021).
  13. Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420 (2021).
  14. Fridman, V., et al. Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo. Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).
  15. Edamatsu, M. Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7. Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).
  16. Popchock, A. R., et al. The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch. Nature Communications. 8, 13999 (2017).
  17. Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9 (9), 51131 (2020).
  18. Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).
  19. Pandey, H., et al. Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).
  20. Shapira, O., Gheber, L. Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain. Scientific Reports. 6, 25597 (2016).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Britto, M., et al. Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).
  23. Kapitein, L. C., et al. Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5. Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).
  24. Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1. Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).
  25. Katrukha, E. A., et al. Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots. Nature Communications. 8, 14772 (2017).
  26. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  27. Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis. eLife. 8, 42288 (2019).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved