Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biochemistry
द्वि-दिशात्मक माइटोटिक किनेसिन -5 Cin8 उन समूहों में जमा होता है जो उनकी गतिशीलता के दौरान विभाजित और विलय करते हैं। समूहों में संचय भी Cin8 के वेग और दिशात्मकता को बदलता है। यहां, शुद्ध Cin8-GFP के साथ गतिशीलता assays के लिए एक प्रोटोकॉल और एकल अणुओं और Cin8 के समूहों के गतिशील गुणों के विश्लेषण का वर्णन किया गया है।
माइटोटिक द्विध्रुवी किनेसिन -5 मोटर्स स्पिंडल गतिशीलता में आवश्यक कार्य करते हैं। ये मोटर्स उत्प्रेरक मोटर डोमेन के दो जोड़े के साथ एक होमो-टेट्रामेरिक संरचना प्रदर्शित करते हैं, जो सक्रिय परिसर के विपरीत छोर पर स्थित है। यह अद्वितीय वास्तुकला काइनसिन -5 मोटर्स को एंटीपैरेलल स्पिंडल माइक्रोट्यूबुल्स (एमटी) के अलावा क्रॉसलिंक और स्लाइड करने में सक्षम बनाती है, इस प्रकार बाहरी रूप से निर्देशित बल प्रदान करती है जो स्पिंडल ध्रुवों को अलग करती है। पहले, किनेसिन -5 मोटर्स को विशेष रूप से प्लस-एंड निर्देशित माना जाता था। हालांकि, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि कई फंगल किनेसिन -5 मोटर्स एकल-अणु स्तर पर निर्देशित माइनस-एंड हैं और विभिन्न प्रयोगात्मक परिस्थितियों में दिशात्मकता को स्विच कर सकते हैं। Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 इस तरह के द्वि-दिशात्मक मोटर प्रोटीन का एक उदाहरण है: उच्च आयनिक ताकत की स्थिति में Cin8 के एकल अणु एमटी की माइनस-एंड दिशा में चलते हैं। यह भी दिखाया गया था कि Cin8 मुख्य रूप से एमटी के माइनस-एंड पर गतिशील क्लस्टर बनाता है, और इस तरह के क्लस्टरिंग Cin8 को दिशात्मकता को स्विच करने और धीमी गति से, प्लस-एंड निर्देशित गतिशीलता से गुजरने की अनुमति देता है। यह लेख GFP-टैग किए गए kinesin-5 Cin8 के साथ काम करने के सभी चरणों के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है, एस cerevisiae कोशिकाओं में प्रोटीन overexpression से और विट्रो एकल-अणु गतिशीलता परख में इसकी शुद्धि से। यहां वर्णित एक नई विकसित विधि एकल अणुओं और Cin8 के समूहों के बीच अंतर करने में मदद करती है, जो उनकी प्रतिदीप्ति तीव्रता के आधार पर है। यह विधि एकल अणुओं और Cin8 के समूहों की गतिशीलता के अलग-अलग विश्लेषण को सक्षम बनाती है, इस प्रकार इसके क्लस्टर आकार पर Cin8 गतिशीलता की निर्भरता का लक्षण वर्णन प्रदान करती है।
यूकेरियोटिक कोशिकाओं के भीतर बड़ी संख्या में गतिशीलता की घटनाओं को आणविक मोटर प्रोटीन के कार्य द्वारा मध्यस्थता की जाती है। ये मोटर साइटोस्केलेटल फिलामेंट्स, एक्टिन फिलामेंट्स और सूक्ष्मनलिकाएं (एमटी) के साथ चलती हैं, और एटीपी हाइड्रोलिसिस की रासायनिक ऊर्जा को कोशिकाओं के भीतर जैविक गतिशीलता को चलाने के लिए आवश्यक गतिज और यांत्रिक बलों में परिवर्तित करती हैं। एमटी-आधारित एस cerevisiae Cin8 एक द्विध्रुवी, homotetrameric kinesin-5 मोटर प्रोटीन है जो क्रॉसलिंक करता है और स्पिंडल एमटी को1 के अलावा स्लाइड करता है। Cin8 माइटोसिस के दौरान आवश्यक कार्य करता है, स्पिंडल असेंबली 2,3,4
1. बफर और अभिकर्मकों की तैयारी
प्रयोग का उद्देश्य एकल MTs पर विभिन्न क्लस्टर आकारों के द्वि-दिशात्मक मोटर प्रोटीन Cin8 की गतिशीलता विशेषताओं की जांच करना है। Cin8-GFP की प्रतिनिधि गतिशीलता चित्र 5A में kymographs से भी स्पष्ट है, जहां समय .......
इस काम में, द्वि-दिशात्मक kinesin-5 Cin8 और गतिशीलता विश्लेषण के साथ एकल-अणु गतिशीलता परख के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है। सी-टर्मिनल पर देशी परमाणु स्थानीयकरण संकेत (एनएलएस) सहित पूर्ण लंबाईCin8 .......
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adenine | FORMEDIUM | DOC0230 | |
ATP | Sigma | A7699 | |
Biotinylated-BSA | Sigma | A8549 | |
Casein | Sigma | C7078 | |
Catalase (C40) | Sigma | C40 | |
Creatine-Kinase | Sigma | C3755 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
EDTA | Sigma | E5134 | |
EGTA | Sigma | E4378 | |
Fluorescence filter set for GFP | Chroma | 49002: ET-EGFP (FITC/Cy2) | |
Fluorescence filter set for Rhodamine | Chroma | 49004: ET-CY3/TRITC | |
Fluorescence inverted microscope | Zeiss | Axiovert 200M | |
Galactose | Tivan Biotech | GAL02 | |
Glucose | Sigma | G8270 | |
Glucose Oxidase | Sigma | G7141 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
GlycylGlycine | Merck | G0674 | |
GMPCPP | Jana Bioscience | Nu-405L | |
GTB | Cytoskeleton | BST01-010 | |
GTP | Sigma | G8877 | |
Histidine | Duchefa Biochemie | H0710.0100 | |
ImageJ-FIJI software | https://imagej.net/plugins/trackmate/ | version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10 | |
Imidazole | Sigma | I0125 | |
InstantBlue Coomassie Protein Stain | Abcam | ab119211 | |
Lens | Zeiss | 100x/1.4 oil DIC objective | |
Lysine | FORMEDIUM | DOC0161 | |
Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
Methionine | Duchefa Biochemie | M0715.0100 | |
Neo | Andor Technologies | sCMOS camera | |
NeutraAvidin | Life | A2666 | |
Ni-NTA Agarose | Invitrogen | R901-15 | |
Phospho-Creatine | Sigma | P1937 | |
Pipes | Sigma | P1851 | |
Pluronic acid F-127 (poloxamer) | Sigma | P2443 | |
Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
Raffinose | Tivan Biotech | RAF01 | |
Size Exclusion chromatography instument | GE Healthcare | AKTA Pure | |
Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | NanoDrop | |
Superose-6 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
Tris | Roshe | 10708976001 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Tryptophan | Duchefa Biochemie | T0720.0100 | |
Tubulin protein | Cytoskeleton | T240 | |
Tubulin, biotinylated | Cytoskeleton | T333P | |
Tubulin, TRITC Rhodamine | Cytoskeleton | TL530M | |
Uracil | Sigma | U0750-100G | |
Yeast nitrogen base | FORMEDIUM | CYN0401S | |
α-GFP antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC8036 | |
β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 |
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