Motilità di singole molecole e cluster di Kinesin-5 Cin8 bidirezionale purificata da cellule S. cerevisiae

La cinesina mitotica bidirezionale-5 Cin8 si accumula in ammassi che si dividono e si fondono durante la loro motilità. L'accumulo negli ammassi cambia anche la velocità e la direzionalità di Cin8. Qui viene descritto un protocollo per saggi di motilità con Cin8-GFP purificato e analisi delle proprietà mobili di singole molecole e cluster di Cin8.

I motori mitotici bipolari kinesin-5 svolgono funzioni essenziali nella dinamica del mandrino. Questi motori presentano una struttura omo-tetramerica con due coppie di domini motori catalitici, situati alle estremità opposte del complesso attivo. Questa architettura unica consente ai motori kinesin-5 di reticolare e far scorrere i microtubuli antiparallelo del mandrino (MT), fornendo così la forza diretta verso l'esterno che separa i poli del mandrino. In precedenza, si riteneva che i motori kinesin-5 fossero esclusivamente diretti verso il plus-end. Tuttavia, studi recenti hanno rivelato che diversi motori fungini kinesin-5 sono meno diretti a livello di singola molecola e possono cambiare direzionalità in varie condizioni sperimentali. Il Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 è un esempio di tale proteina motoria bidirezionale: in condizioni di elevata forza ionica singole molecole di Cin8 si muovono nella direzione meno-estremità delle MT. È stato anche dimostrato che Cin8 forma ammassi mobili, prevalentemente all'estremità negativa delle MT, e tale clustering consente a Cin8 di cambiare direzionalità e subire una motilità lenta e diretta plus-end. Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per tutte le fasi di lavoro con kinesin-5 Cin8 con tag GFP, dalla sovraespressione proteica nelle cellule di S. cerevisiae e la sua purificazione al saggio di motilità a singola molecola in vitro . Un metodo di nuova concezione qui descritto aiuta a distinguere tra singole molecole e cluster di Cin8, in base alla loro intensità di fluorescenza. Questo metodo consente un'analisi separata della motilità di singole molecole e cluster di Cin8, fornendo così la caratterizzazione della dipendenza della motilità di Cin8 dalla sua dimensione del cluster.

Un gran numero di eventi di motilità all'interno delle cellule eucariotiche sono mediati dalla funzione delle proteine motorie molecolari. Questi motori si muovono lungo i filamenti citoscheletrici, i filamenti di actina e i microtubuli (MT) e convertono l'energia chimica dell'idrolisi dell'ATP in forze cinetiche e meccaniche necessarie per guidare la motilità biologica all'interno delle cellule. La S. cerevisiae Cin8 basata su MT è una proteina motoria bipolare omotetramerica kinesin-5 che reticola e fa scorrere le MT a parte¹. Cin8 svolge funzioni essenziali durante la mitosi, nell'assemblaggio del mandrino

1. Preparazione di tamponi e reagenti

1. Buffer
   1. -Leu aa dropout mix: mescolare 2 g ciascuno di adenina, uracile, triptofano, istidina, lisina e metionina e conservare a temperatura ambiente.
   2. Mezzo selettivo di lievito con raffinosio (1 L): Mescolare 6,7 g di base di azoto lievitato (con solfato di ammonio), 2 g di miscela di -Leu aa dropout e 20 g di raffinosio in acqua a doppia distillazione mescolando (senza riscaldamento) fino a completa dissoluzione. Utilizzando un filtro da.......

L'esperimento mira a studiare le caratteristiche di motilità della proteina motoria bidirezionale Cin8 di diverse dimensioni di cluster su singoli MT. La motilità rappresentativa di Cin8-GFP è evidente anche dai chimografi in Figura 5A, dove viene mostrata la posizione spaziale del motore nel tempo.

Per l'analisi delle proprietà mobili di Cin8-GFP, in primo luogo, la dimensione del cluster viene assegnata (passo 4.3) a ciascuna particella cin8-GFP mobile attac.......

In questo lavoro, viene presentato un protocollo per il saggio di motilità a singola molecola con la kinesin-5 bidirezionale Cin8 e l'analisi della motilità. Il Cin8¹⁸ a lunghezza intera, incluso il segnale di localizzazione nucleare nativo (NLS) al C-terminale, è stato purificato dall'ospite nativo S. cerevisiae. Poiché il Cin8 è una proteina del motore nucleare, la macinazione delle cellule S. cerevisiae sotto azoto liquido è il metodo più efficiente per la lisi cellular.......

Questa ricerca è stata sostenuta in parte dalla sovvenzione della Israel Science Foundation (ISF-386/18) e dalla sovvenzione della Israel Binational Science Foundation (BSF-2019008), assegnata a L.G.