S. cerevisiae細胞から精製された双方向キネシン-5 Cin8の一分子およびクラスターの運動性

双方向有糸分裂キネシン-5 Cin8は、運動性の間に分裂して融合するクラスターに蓄積する。クラスターへの蓄積は、Cin8の速度と方向性も変化させます。ここでは、精製Cin8−GFPを用いた運動性アッセイおよびCin8の単一分子およびクラスターの運動性特性の分析のためのプロトコルが記載されている。

有糸分裂バイポーラキネシン-5モーターは、スピンドルダイナミクスにおいて重要な機能を果たします。これらのモーターは、活性複合体の両端に位置する2対の触媒モータードメインを有するホモ四量体構造を示す。このユニークなアーキテクチャにより、キネシン-5モータは、逆平行スピンドル微小管(MT)を架橋してスライドさせることができ、スピンドルポールを分離する外向きの力を提供します。以前は、キネシン-5モーターはもっぱらプラスエンド指向であると考えられていました。しかし、最近の研究では、いくつかの真菌キネシン-5モーターがマイナス末端が単一分子レベルに向けられており、さまざまな実験条件下で方向性を切り替えることができることが明らかになりました。 サッカロミセス・セレビシエ・ キネシン−5 Cin8は、そのような双方向モータータンパク質の一例である:高イオン強度条件下では、Cin8の単一分子はMTのマイナス末端方向に移動する。また、Cin8は主にMTのマイナス端で運動性クラスターを形成し、そのようなクラスタリングはCin8が方向性を切り替え、ゆっくりとしたプラスエンド指向性を経験することを可能にすることも示された。この記事では、 S. cerevisiae 細胞におけるタンパク質過剰発現およびその精製から in vitro 単一分子運動性アッセイまで、GFPタグ付きキネシン-5 Cin8を使用するすべてのステップについて詳細なプロトコルを提供します。ここで説明する新しく開発された方法は、蛍光強度に基づいてCin8の単一分子とクラスターを区別するのに役立ちます。この方法は、Cin8の単一分子およびクラスターの運動性の別々の分析を可能にし、したがって、Cin8の運動性のクラスターサイズに対する依存性の特性評価を提供する。

真核細胞内の多数の運動性事象は、分子運動タンパク質の機能によって媒介される。これらのモーターは、細胞骨格フィラメント、アクチンフィラメント、および微小管(MT)に沿って移動し、ATP加水分解の化学エネルギーを細胞内の生物学的運動性を駆動するために必要な運動学的および機械的力に変換する。MTベースのS. cerevisiae Cin8は、双極性のホモ四量体キネシン-5モータータンパク質であり、スピンドルMTを架橋してスライドさせる¹。Cin8は、有糸分裂中、紡錘体アセンブリ^2,3,4および分裂後期5,6,7中の紡錘体伸長において、本質的な機能を果たす。これまで、Cin8は双方向モータであり、異なる実験条件下で方向性を切り替えることが実証されていました。例えば、高いイオン強度条件下では、単一のCin8モータはMTのマイナス端に向かって移動するが、クラスタでは、マルチモータMTグライダーアッセイでは、および反並列MT間では、Cin8モータは主にMTのプラス端に向かって移動する

1. 緩衝液および試薬の調製

1. バッファー
   1. -Leu aaドロップアウトミックス:アデニン、ウラシル、トリプトファン、ヒスチジン、リジン、メチオニンの各2gを混合し、室温で保存する。
   2. 酵母選択培地とラフィノース(1L):酵母窒素ベース6.7g(硫酸アンモニウムを含む)、2gの-Leu aaドロップアウトミックス、および20gのラフィノースを二重蒸留水に混合し、完全に溶解す.......

この実験は、単一MT上の異なるクラスターサイズの双方向モータータンパク質Cin8の運動性特性を調べることを目的としています。Cin8-GFPの代表的な運動性は、経時的なモーターの空間的位置が示されている 図5Aのキモグラフからも明らかです。

Cin8-GFPの運動特性の分析のために、まず、クラスターサイズを各MT付着運動性Cin8-GFP粒子に割り当て(ステ?.......

この研究では、双方向キネシン-5 Cin8を用いた単一分子運動性アッセイおよび運動性分析のためのプロトコルが提示される。C末端における天然核局在化シグナル(NLS)を含む全長^{Cin8 18} は、天然宿主 S. cerevisiaeから精製されている。Cin8は核モータータンパク質であるため、液体窒素下で セレビシエ 菌細胞を粉砕することが、細胞溶解のための最も効率的な方法で?.......

この研究は、L.G.に授与されたイスラエル科学財団助成金(ISF-386/18)とイスラエル二国間科学財団助成金(BSF-2019008)によって部分的に支援されました。