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Biochemistry

S. cerevisiae 세포로부터 정제된 양방향 Kinesin-5 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 이동성

Published: February 2nd, 2022

DOI:

10.3791/63425

1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, Israel, 2Department of Biotechnology Engineering, Ben-Gurion University of the Negev, Israel

양방향 유사분열 키네신-5 Cin8은 운동성 동안 분열되고 병합되는 클러스터에 축적됩니다. 클러스터에 축적되면 Cin8의 속도와 방향성도 변경됩니다. 여기에서, 정제된 Cin8-GFP를 사용한 운동성 분석 및 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 모타일 특성의 분석을 위한 프로토콜이 기재되어 있다.

유사분열성 양극성 키네신-5 모터는 스핀들 역학에서 필수적인 기능을 수행합니다. 이 모터는 활성 복합체의 반대쪽 끝에 위치한 두 쌍의 촉매 모터 도메인을 가진 호모 사량체 구조를 나타냅니다. 이 독특한 아키텍처는 kinesin-5 모터가 반평행 스핀들 미세소관(MT)을 가교 및 분리할 수 있게 해줌으로써 스핀들 극을 분리하는 외향 지향적인 힘을 제공합니다. 이전에는 kinesin-5 모터가 독점적으로 플러스 엔드 지향으로 여겨졌습니다. 그러나 최근 연구에 따르면 여러 곰팡이 키네신 -5 모터는 단일 분자 수준에서 향하는 마이너스 엔드이며 다양한 실험 조건에서 방향성을 전환 할 수 있습니다. Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8은 이러한 양방향 운동 단백질의 예입니다 : 높은 이온 강도 조건에서 Cin8의 단일 분자가 MT의 마이너스 - 끝 방향으로 움직입니다. 또한 Cin8은 주로 MT의 마이너스 말단에 모타일 클러스터를 형성하며, 이러한 클러스터링을 통해 Cin8은 방향성을 전환하고 느리고 플러스 엔드 지향 운동성을 겪을 수 있습니다. 이 기사는 S. cerevisiae 세포에서의 단백질 과발현 및 그의 정제에서부터 시험관내 단일 분자 운동성 분석에 이르기까지 GFP 태깅된 키네신-5 Cin8로 작업하는 모든 단계에 대한 상세한 프로토콜을 제공한다. 여기에 설명 된 새로 개발 된 방법은 형광 강도에 따라 Cin8의 단일 분자와 클러스터를 구별하는 데 도움이됩니다. 이 방법은 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 운동성에 대한 별도의 분석을 가능하게하여 클러스터 크기에 대한 Cin8 운동성의 의존성의 특성을 제공합니다.

진핵 세포 내의 많은 운동성 사건은 분자 운동 단백질의 기능에 의해 매개된다. 이 모터는 세포 골격 필라멘트, 액틴 필라멘트 및 미세 소관 (MTs)을 따라 움직이며 ATP 가수분해의 화학 에너지를 세포 내에서 생물학적 운동성을 유도하는 데 필요한 운동 및 기계적 힘으로 변환합니다. MT 기반 S. cerevisiae Cin8은 양극성, 호모테트라머 키네신-5 모터 단백질로, 스핀들 MT를 교차 연결하고슬라이드합니다 1. Cin8은 유사분열 동안, 스핀들 어셈블리 2,3,4 및 아나페이즈 5,6,7 동안 스핀들 신장에서 필수 기능을 수행합니다. 이전에는 Cin8이 다양한 실험 조건에서 방향성을 전환하는 양방향 모터라는 것이 입증되었습니다. 예를 들어, 높은 이온 강도 조건에서 단일 Cin8 모터는 MT의 마이너스 끝쪽으로 이동하지만 클러스터, 다중 모터 MT 글라이딩 분석 및 병렬 MT 사이에서 Cin8....

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1. 완충제 및 시약의 제조

  1. 버퍼
    1. -Leu aa 드롭아웃 믹스: 아데닌, 우라실, 트립토판, 히스티딘, 라이신, 메티오닌 각각 2g을 섞어 실온에서 보관한다.
    2. 효모 선택 배지와 라피노스 (1 L): 완전히 용해될 때까지 교반하여(가열 없이) 이중 증류수에 효모 질소 염기 6.7 g(황산암모늄 포함), 2 g의 -Leu aa 드롭아웃 믹스 및 20 g의 라피노오스를 혼합한다. 0.22 μm 필터를 사용하여, ?.......

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이 실험은 단일 MT에서 서로 다른 클러스터 크기의 양방향 모터 단백질 Cin8의 운동성 특성을 조사하는 것을 목표로합니다. Cin8-GFP의 대표적인 운동성은 시간에 따른 모터의 공간 위치가 표시된 그림 5A의 키모 그래프에서도 분명합니다.

Cin8-GFP의 모타일 특성의 분석을 위해, 먼저, 클러스터 크기가 각각의 MT 부착 모타일 Cin8-GFP 입자에 할당되고(단계 4.3), ?.......

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이 연구에서는 양방향 키네신-5 Cin8을 사용한 단일 분자 운동성 분석 및 운동성 분석을 위한 프로토콜이 제시된다. C 말단에서 천연 핵 국재화 신호(NLS)를 포함하는 전장Cin8(18 )은 천연 숙주 S. 세레비시아로부터 정제되었다. Cin8은 핵 운동 단백질이기 때문에 액체 질소 하에서 S. cerevisiae 세포를 분쇄하는 것이 세포 용해를위한 가장 효율적인 방법임이 밝혀졌습니다. ?.......

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이 연구는 L.G.에 수여 된 이스라엘 과학 재단 보조금 (ISF-386/18)과 이스라엘 이중 국가 과학 재단 보조금 (BSF-2019008)에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

....

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NameCompanyCatalog NumberComments
AdenineFORMEDIUMDOC0230
ATPSigmaA7699
Biotinylated-BSASigmaA8549
CaseinSigmaC7078
Catalase (C40)SigmaC40
Creatine-KinaseSigmaC3755
Dithiothreitol (DTT)SigmaD0632
EDTASigmaE5134
EGTASigmaE4378
Fluorescence filter set for GFPChroma49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)
Fluorescence filter set for RhodamineChroma49004: ET-CY3/TRITC
Fluorescence inverted microscopeZeissAxiovert 200M
GalactoseTivan BiotechGAL02
GlucoseSigmaG8270
Glucose OxidaseSigmaG7141
GlycerolSigmaG5516
GlycylGlycineMerckG0674
GMPCPPJana BioscienceNu-405L
GTBCytoskeletonBST01-010
GTPSigmaG8877
HistidineDuchefa BiochemieH0710.0100
ImageJ-FIJI softwarehttps://imagej.net/plugins/trackmate/version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10
ImidazoleSigmaI0125
InstantBlue Coomassie Protein StainAbcamab119211
LensZeiss100x/1.4 oil DIC objective
LysineFORMEDIUMDOC0161
Magnesium ChlorideSigmaM8266
MethionineDuchefa BiochemieM0715.0100
NeoAndor TechnologiessCMOS camera
NeutraAvidinLifeA2666
Ni-NTA AgaroseInvitrogenR901-15
Phospho-CreatineSigmaP1937
PipesSigmaP1851
Pluronic acid F-127 (poloxamer)SigmaP2443
Potassium ChlorideSigmaP9541
RaffinoseTivan BiotechRAF01
Size Exclusion chromatography instumentGE HealthcareAKTA Pure
SpectrophotometerThermoFisher ScientificNanoDrop
Superose-6 10/300 GLGE Healthcare17-5172-01
TrisRoshe10708976001
Triton X-100SigmaT8787
TryptophanDuchefa BiochemieT0720.0100
Tubulin proteinCytoskeletonT240
Tubulin, biotinylatedCytoskeletonT333P
Tubulin, TRITC RhodamineCytoskeletonTL530M
UracilSigmaU0750-100G
Yeast nitrogen baseFORMEDIUMCYN0401S
α-GFP antibodySanta Cruz BiotechnologySC8036
β-mercaptoethanolSigmaM3148

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