Motilitet av enkeltmolekyler og klynger av toveis Kinesin-5 Cin8 renset fra S. cerevisiae celler

Den toveis mititotiske kinesin-5 Cin8 akkumuleres i klynger som deler og fusjonerer under deres motilitet. Akkumulering i klynger endrer også hastigheten og direksjonaliteten til Cin8. Her beskrives en protokoll for motilitetsanalyser med renset Cin8-GFP og analyse av motile egenskaper av enkeltmolekyler og klynger av Cin8.

De mititotiske bipolare kinesin-5-motorene utfører viktige funksjoner i spindeldynamikk. Disse motorene har en homo-tetramerisk struktur med to par katalytiske motordomener, plassert i motsatte ender av det aktive komplekset. Denne unike arkitekturen gjør det mulig for kinesin-5-motorer å krysslinke og skyve fra hverandre antiparallel spindelmikrotubuler (MTs), og dermed gi den utadrettede kraften som skiller spindelstengene fra hverandre. Tidligere ble kinesin-5-motorer antatt å være utelukkende pluss-end rettet. Nyere studier viste imidlertid at flere soppkinesin-5-motorer er minus-end rettet mot enkeltmolekylnivå og kan bytte direksjonalitet under ulike eksperimentelle forhold. Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 er et eksempel på et slikt toveis motorprotein: i høye ioniske styrkeforhold beveger enkeltmolekyler av Cin8 seg i minus-end retning av MTs. Det ble også vist at Cin8 danner motile klynger, hovedsakelig i minus-enden av MTs, og slik klynge gjør at Cin8 kan bytte direksjonalitet og gjennomgå langsom, pluss-end rettet motilitet. Denne artikkelen gir en detaljert protokoll for alle trinn i arbeidet med GFP-tagged kinesin-5 Cin8, fra proteinovertrykk i S. cerevisiae-celler og dens rensing til in vitro enkeltmolekylsmotilitetsanalyse. En nyutviklet metode beskrevet her bidrar til å skille mellom enkeltmolekyler og klynger av Cin8, basert på deres fluorescensintensitet. Denne metoden muliggjør separat analyse av motilitet av enkeltmolekyler og klynger av Cin8, og gir dermed karakterisering av avhengigheten av Cin8-motilitet på klyngestørrelsen.

Et stort antall motilitetshendelser innen eukaryote celler formidles av funksjonen til molekylære motorproteiner. Disse motorene beveger seg langs cytoskeletalfilamenter, aktinfilamenter og mikrotubuler (MTs), og konverterer den kjemiske energien til ATP hydrolyse til kinetiske og mekaniske krefter som kreves for å drive biologisk bevegelighet i celler. Det MT-baserte S. cerevisiae Cin8 er et bipolart, homotetramerisk kinesin-5 motorprotein som krysser og skyver spindel-MTs fra hverandre¹. Cin8 utfører viktige funksjoner under mitose, i spindelmontering ^2,3,4

1. Utarbeidelse av buffere og reagenser

1. Buffere
   1. -Leu aa dropout mix: Bland 2 g hver av Adenine, Uracil, Tryptophan, Histidine, Lysine og Methionine og lagre ved romtemperatur.
   2. Gjær selektiv medium med raffinose (1 L): Bland 6,7 g gjær nitrogenbase (med ammoniumsulfat), 2 g -Leu aa dropout mix og 20 g raffinose i dobbeltdestillert vann ved omrøring (uten oppvarming) til den er helt oppløst. Bruk et filter på 0,22 μm til å filtrere oppløsningen inn i en steril flaske........

Eksperimentet tar sikte på å undersøke motility egenskapene til toveis motorprotein Cin8 av forskjellige klyngestørrelser på enkelt MTs. Representativ motilitet av Cin8-GFP er også tydelig fra kymografene i figur 5A, hvor motorens romlige posisjon over tid vises.

For analyse av motile egenskapene til Cin8-GFP, først, er klyngestørrelsen tildelt (trinn 4.3) til hver MT-festet motil Cin8-GFP-partikkel, og deretter spores posisjonen til de undersøkte Cin8-pa.......

I dette arbeidet presenteres en protokoll for enkeltmolekylell motilitetsanalyse med toveis kinesin-5 Cin8 og motilitetsanalysen. Cin8¹⁸ i full lengde, inkludert det opprinnelige kjernefysiske lokaliseringssignalet (NLS) på C-terminalen, er renset fra den innfødte verten S. cerevisiae. Siden Cin8 er et kjernemotorprotein, er sliping av S. cerevisiae-cellene under flytende nitrogen funnet å være den mest effektive metoden for cellelys. Etter lysis, ved å kombinere metallaffin.......

Denne forskningen ble delvis støttet av Israel Science Foundation grant (ISF-386/18) og Israel Binational Science Foundation grant (BSF-2019008), tildelt L.G.