Подвижность одиночных молекул и кластеров двунаправленного кинезина-5 Cin8, очищенного из клеток S. cerevisiae

Двунаправленный митотический кинезин-5 Cin8 накапливается в кластерах, которые расщепляются и сливаются во время их подвижности. Накопление в кластерах также изменяет скорость и направленность Cin8. Здесь описан протокол анализа подвижности с очищенным Cin8-GFP и анализа подвижных свойств отдельных молекул и кластеров Cin8.

Митотические биполярные двигатели кинезин-5 выполняют важные функции в динамике шпинделя. Эти двигатели демонстрируют гомотетрамерную структуру с двумя парами каталитических моторных доменов, расположенных на противоположных концах активного комплекса. Эта уникальная архитектура позволяет двигателям кинезина-5 сшивать и раздвигать антипараллельные шпиндельные микротрубочки (МТ), обеспечивая тем самым направленную наружу силу, которая разделяет полюса шпинделя друг от друга. Ранее считалось, что двигатели кинезин-5 направлены исключительно с плюс-концом. Однако недавние исследования показали, что несколько грибковых двигателей кинезин-5 направлены на уровень одной молекулы и могут переключать направленность в различных экспериментальных условиях. Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 является примером такого двунаправленного моторного белка: в условиях высокой ионной прочности отдельные молекулы Cin8 движутся в направлении минус-конца MTs. Также было показано, что Cin8 образует подвижные кластеры, преимущественно на минусовом конце МТ, и такая кластеризация позволяет Cin8 переключать направленность и подвергаться медленной, плюс-конечной направленной подвижности. В этой статье представлен подробный протокол для всех этапов работы с GFP-меченым кинезином-5 Cin8, от гиперэкспрессии белка в клетках S. cerevisiae и его очистки до анализа подвижности одной молекулы in vitro . Недавно разработанный метод, описанный здесь, помогает дифференцировать отдельные молекулы и кластеры Cin8 на основе их интенсивности флуоресценции. Этот метод позволяет проводить раздельный анализ подвижности отдельных молекул и кластеров Cin8, обеспечивая тем самым характеристику зависимости подвижности Cin8 от размера кластера.

Большое количество событий подвижности в эукариотических клетках опосредовано функцией молекулярных моторных белков. Эти двигатели движутся вдоль цитоскелетных нитей, актиновых нитей и микротрубочек (МТ) и преобразуют химическую энергию гидролиза АТФ в кинетические и механические силы, необходимые для управления биологической подвижностью внутри клеток. S. cerevisiae Cin8 на основе MT представляет собой биполярный гомотетрамерный моторный белок кинезин-5, который сшивает и скользит веретено MTs друг от^{друга 1}. Cin8 выполняет важнейшие функции при митозе, в веретенообразном сборе ^2,3,4

1. Подготовка буферов и реагентов

1. Буферов
   1. -Leu aa dropout mix: смешайте по 2 г аденина, урацила, триптофана, гистидина, лизина и метионина и храните при комнатной температуре.
   2. Дрожжевая селективная среда с рафинозой (1 л): Смешайте 6,7 г дрожжевой азотистой основы (с сульфато?.......

Эксперимент направлен на исследование характеристик подвижности двунаправленного моторного белка Cin8 различных размеров кластера на одиночных МТ. Репрезентативная подвижность Cin8-GFP также очевидна из кимографов на рисунке 5А, где показано пространственное положение д?.......

В данной работе представлен протокол анализа подвижности одной молекулы с двунаправленным кинезином-5 Cin8 и анализа подвижности. Полноразмерный Cin8¹⁸ , включая сигнал собственной ядерной локализации (NLS) на С-терминале, был очищен от собственного хозяина S. cerevisiae. Посколь?.......

Это исследование было частично поддержано грантом Израильского научного фонда (ISF-386/18) и грантом Израильского двустороннего научного фонда (BSF-2019008), присужденным L.G.