Motilidad de moléculas individuales y grupos de cinesina-5 cin8 bidireccional purificada a partir de células de S. cerevisiae

La kinesina-5 Cin8 mitótica bidireccional se acumula en grupos que se dividen y fusionan durante su motilidad. La acumulación en grupos también cambia la velocidad y direccionalidad de Cin8. Aquí, se describe un protocolo para ensayos de motilidad con Cin8-GFP purificado y análisis de propiedades móviles de moléculas individuales y grupos de Cin8.

Los motores mitotic bipolares kinesina-5 realizan funciones esenciales en la dinámica del huso. Estos motores exhiben una estructura homo-tetramérica con dos pares de dominios motores catalíticos, ubicados en extremos opuestos del complejo activo. Esta arquitectura única permite que los motores de kinesina-5 se entrecrucen y deslicen los microtúbulos (TM) del husillo antiparalelo, proporcionando así la fuerza dirigida hacia afuera que separa los polos del husillo. Anteriormente, se creía que los motores de kinesina-5 estaban dirigidos exclusivamente al extremo superior. Sin embargo, estudios recientes revelaron que varios motores fúngicos de quinesina-5 son de extremo negativo dirigidos al nivel de una sola molécula y pueden cambiar de direccionalidad bajo diversas condiciones experimentales. La quinasina-5 Cin8 de Saccharomyces cerevisiae es un ejemplo de dicha proteína motora bidireccional: en condiciones de alta fuerza iónica, las moléculas individuales de Cin8 se mueven en la dirección del extremo inferior de los MT. También se demostró que Cin8 forma cúmulos móviles, predominantemente en el extremo inferior de los MT, y dicho agrupamiento permite que Cin8 cambie de direccionalidad y experimente una motilidad dirigida lenta y más al final. Este artículo proporciona un protocolo detallado para todos los pasos de trabajo con kinesina-5 Cin8 marcada con GFP, desde la sobreexpresión de proteínas en células de S. cerevisiae y su purificación hasta el ensayo de motilidad de molécula única in vitro . Un método recientemente desarrollado que se describe aquí ayuda a diferenciar entre moléculas individuales y grupos de Cin8, en función de su intensidad de fluorescencia. Este método permite un análisis separado de la motilidad de moléculas individuales y grupos de Cin8, proporcionando así la caracterización de la dependencia de la motilidad de Cin8 en su tamaño de racimo.

Un gran número de eventos de motilidad dentro de las células eucariotas están mediados por la función de las proteínas motoras moleculares. Estos motores se mueven a lo largo de los filamentos citoesqueléticos, filamentos de actina y microtúbulos (TM), y convierten la energía química de la hidrólisis de ATP en fuerzas cinéticas y mecánicas necesarias para impulsar la motilidad biológica dentro de las células. La S. cerevisiae Cin8 basada en MT es una proteína motora bipolar homotetramérica de quinesina-5 que se entrelaza y desliza las MT del huso¹. Cin8 realiza funciones esenciales durante la mitosis, en el ensamblaje del huso

1. Preparación de tampones y reactivos

1. Búferes
   1. -Mezcla de gotas de Leu aa: Mezclar 2 g cada uno de Adenina, Uracilo, Triptófano, Histidina, Lisina y Metionina y almacenar a temperatura ambiente.
   2. Medio selectivo de levadura con rafinosa (1 L): Mezcle 6,7 g de base de nitrógeno de levadura (con sulfato de amonio), 2 g de mezcla de gota de -Leu aa y 20 g de rafinosa en agua de doble destilación revolviendo (sin calentar) hasta que se disuelva por completo. Con un filtro de .......

El experimento tiene como objetivo investigar las características de motilidad de la proteína motora bidireccional Cin8 de diferentes tamaños de grupo en TM individuales. La motilidad representativa de Cin8-GFP también es evidente en los kymographs de la Figura 5A, donde se muestra la posición espacial del motor a lo largo del tiempo.

Para el análisis de las propiedades móviles de Cin8-GFP, primero, se asigna el tamaño del clúster (paso 4.3) a cada partí.......

En este trabajo se presenta un protocolo para el ensayo de motilidad monomolécula con la kinesina-5 Cin8 bidireccional y el análisis de motilidad. El Cin8¹⁸ de longitud completa, incluida la señal de localización nuclear nativa (NLS) en el terminal C, se ha purificado del huésped nativo S. cerevisiae. Como el Cin8 es una proteína motora nuclear, la molienda de las células de S. cerevisiae bajo nitrógeno líquido se encuentra como el método más eficiente para la lisis ce.......

Esta investigación fue apoyada en parte por la subvención de la Fundación de Ciencias de Israel (ISF-386/18) y la subvención de la Fundación Binacional de Ciencias de Israel (BSF-2019008), otorgada a L.G.