Motilitet av enskilda molekyler och kluster av dubbelriktad kinesin-5 Cin8 renad från S. cerevisiae-celler

Den dubbelriktade mitotiska kinesin-5 Cin8 ackumuleras i kluster som splittras och smälter samman under deras rörlighet. Ackumulering i kluster förändrar också hastigheten och riktningen hos Cin8. Här beskrivs ett protokoll för motilitetsanalyser med renad Cin8-GFP och analys av rörliga egenskaper hos enskilda molekyler och kluster av Cin8.

De mitotiska bipolära kinesin-5-motorerna utför väsentliga funktioner i spindeldynamiken. Dessa motorer uppvisar en homo-tetramerisk struktur med två par katalytiska motordomäner, belägna i motsatta ändar av det aktiva komplexet. Denna unika arkitektur gör det möjligt för kinesin-5-motorer att tvärlänka och glida isär antiparallella spindelmikrotubuli (MT), vilket ger den utåtriktade kraften som skiljer spindelpolerna från varandra. Tidigare trodde man att kinesin-5-motorer uteslutande var plus-end-riktade. Nya studier visade emellertid att flera svampkinesin-5-motorer är minus-end riktade mot enmolekylnivå och kan byta riktning under olika experimentella förhållanden. Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 är ett exempel på sådant dubbelriktat motoriskt protein: under förhållanden med hög jonstyrka rör sig enskilda molekyler av Cin8 i minus-end-riktningen för MT: erna. Det visades också att Cin8 bildar rörliga kluster, främst vid minus-änden av MTs, och sådan klustring gör det möjligt för Cin8 att byta riktning och genomgå långsam, plus-end riktad motilitet. Denna artikel ger ett detaljerat protokoll för alla steg i arbetet med GFP-märkt kinesin-5 Cin8, från proteinöveruttryck i S. cerevisiae-celler och dess rening till in vitro-enmolekyls motilitetsanalys. En nyutvecklad metod som beskrivs här hjälper till att skilja mellan enskilda molekyler och kluster av Cin8, baserat på deras fluorescensintensitet. Denna metod möjliggör separat analys av rörligheten hos enskilda molekyler och kluster av Cin8, vilket ger karakteriseringen av beroendet av Cin8-motilitet på dess klusterstorlek.

Ett stort antal motilitetshändelser inom eukaryota celler medieras av funktionen av molekylära motorproteiner. Dessa motorer rör sig längs cytoskelettfilamenten, aktinfilamenten och mikrotubuli (MT) och omvandlar den kemiska energin hos ATP-hydrolys till kinetiska och mekaniska krafter som krävs för att driva biologisk motilitet i celler. Mt-baserade S. cerevisiae Cin8 är ett bipolärt, homotetrameriskt kinesin-5-motorprotein som tvärlänkar och skjuter spindel-MT isär¹. Cin8 utför väsentliga funktioner under mitos, i spindelaggregat ^2,3,4 och s....

1. Beredning av buffertar och reagenser

1. Buffertar
   1. -Leu aa dropout mix: Blanda 2 g vardera av Adenin, Uracil, Tryptofan, Histidin, Lysin, och Metionin och förvara vid rumstemperatur.
   2. Jästselektivt medium med raffinos (1 liter): Blanda 6,7 g jästkvävebas (med ammoniumsulfat), 2 g -Leu aa dropout-blandning och 20 g raffinos i dubbeldestillerat vatten under omrörning (utan uppvärmning) tills det är helt upplöst. Filtrera lösningen i en steril flaska med ett 0,22 μm filt.......

Experimentet syftar till att undersöka motilitetsegenskaperna hos dubbelriktat motoriskt protein Cin8 av olika klusterstorlekar på enstaka MTs. Representativ motilitet hos Cin8-GFP framgår också av kymograferna i figur 5A, där motorns rumsliga position över tid visas.

För analys av de rörliga egenskaperna hos Cin8-GFP tilldelas först klusterstorleken (steg 4.3) till varje MT-fäst rörlig Cin8-GFP-partikel, och sedan spåras positionen för de undersökta.......

I detta arbete presenteras ett protokoll för enmolekylig motilitetsanalys med dubbelriktad kinesin-5 Cin8 och motilitetsanalysen. Fullängdaren Cin8¹⁸ inklusive den ursprungliga kärnlokaliseringssignalen (NLS) vid C-terminalen har renats från den inhemska värden S. cerevisiae. Eftersom Cin8 är ett kärnmotorprotein har slipning av S. cerevisiae-cellerna under flytande kväve visat sig vara den mest effektiva metoden för celllys. Efter lys, genom att kombinera metallaffinite.......

Denna forskning stöddes delvis av Israel Science Foundation-bidraget (ISF-386/18) och Israel Binational Science Foundation-bidraget (BSF-2019008), tilldelat L.G.