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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

La ghiandola pituitaria è il regolatore chiave del sistema endocrino del corpo. Questo articolo descrive lo sviluppo di organoidi dall'ipofisi del topo come un nuovo modello 3D in vitro per studiare la popolazione di cellule staminali della ghiandola di cui la biologia e la funzione rimangono poco comprese.

Abstract

L'ipofisi è la ghiandola endocrina principale che regola i processi fisiologici chiave, tra cui la crescita del corpo, il metabolismo, la maturazione sessuale, la riproduzione e la risposta allo stress. Più di un decennio fa, le cellule staminali sono state identificate nella ghiandola pituitaria. Tuttavia, nonostante l'applicazione di approcci transgenici in vivo , il loro fenotipo, la biologia e il ruolo rimangono poco chiari. Per affrontare questo enigma, viene sviluppato un nuovo e innovativo modello organoide in vitro per svelare in profondità la biologia delle cellule staminali ipofisarie. Gli organoidi rappresentano strutture cellulari 3D che, in condizioni di coltura definite, si auto-sviluppano dalle cellule staminali (epiteliali) di un tessuto e ricapitolano molteplici segni distintivi di tali cellule staminali e del loro tessuto. È mostrato qui che gli organoidi derivati dall'ipofisi di topo si sviluppano dalle cellule staminali della ghiandola e ricapitolano fedelmente le loro caratteristiche fenotipiche e funzionali in vivo . Tra gli altri, riproducono lo stato di attivazione delle cellule staminali come in vivo che si verifica in risposta al danno locale inflitto transgenicamente. Gli organoidi sono espandibili a lungo termine pur mantenendo robustamente il loro fenotipo di staminalità. Il nuovo modello di ricerca è molto prezioso per decifrare il fenotipo e il comportamento delle cellule staminali durante le condizioni chiave del rimodellamento ipofisario, che vanno dalla maturazione neonatale allo sbiadimento associato all'invecchiamento e dalle ghiandole sane a quelle malate. Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per stabilire organoidi derivati dall'ipofisi di topo, che forniscono un potente strumento per immergersi nel mondo ancora enigmatico delle cellule staminali ipofisarie.

Introduzione

L'ipofisi è una piccola ghiandola endocrina situata alla base del cervello, dove è collegata all'ipotalamo. La ghiandola integra input periferici e centrali (ipotalamici) per generare un rilascio ormonale sintonizzato e coordinato, regolando così gli organi endocrini bersaglio a valle (come ghiandole surrenali e gonadi) per produrre ormoni appropriati al momento giusto. L'ipofisi è il regolatore chiave del sistema endocrino ed è quindi giustamente definita la ghiandola principale1.

L'ipofisi del topo è costituita da tre lobi (Figura 1), cioè il lobo anteriore (AL), il lobo intermedio (IL) e il lobo posteriore (PL). Il principale AL endocrino contiene cinque tipi di cellule ormonali, compresi i somatotropi che producono l'ormone della crescita (GH); lattotropi che generano prolattina (PRL); corticotropi che secernono ormone adrenocorticotropo (ACTH); tireotropi responsabili della produzione di ormone stimolante la tiroide (TSH); e gonadotropi che producono l'ormone luteinizzante (LH) e l'ormone follicolo-stimolante (FSH). Il PL consiste in proiezioni assonali dall'ipotalamo in cui sono immagazzinati gli ormoni ossitocina e vasopressina (ormone antidiuretico). L'IL si trova tra l'AL e il PL e ospita melanotropi che producono l'ormone stimolante i melanociti (MSH). Nell'ipofisi umana, l'IL regredisce durante lo sviluppo e i melanotropi si diffondono all'interno dell'AL1. Oltre alle cellule endocrine, la ghiandola pituitaria contiene anche un pool di cellule staminali, essenzialmente contrassegnate dal fattore di trascrizione SOX2 2,3,4,5,6. Queste cellule SOX2+ si trovano nella zona marginale (MZ), il rivestimento epiteliale della fessura (un lume residuo embrionale tra AL e IL), o sono diffuse come cluster in tutto il parenchima dell'AL, proponendo così due nicchie di cellule staminali nella ghiandola (Figura 1)2,3,4,5,6.

Data la natura indispensabile dell'ipofisi, il malfunzionamento della ghiandola è associato a una grave morbilità. L'iperpituitarismo (caratterizzato da eccessiva secrezione di uno o più ormoni) e l'ipopituitarismo (produzione difettosa o mancante di uno o più ormoni) possono essere causati da tumori neuroendocrini ipofisari (PitNET; ad esempio, tumori che producono ACTH che portano alla malattia di Cushing) o da difetti genetici (ad esempio, deficit di GH con conseguente nanismo)7. Inoltre, la chirurgia ipofisaria (ad esempio, per rimuovere i tumori), le infezioni (ad esempio, la tubercolosi ipotalamo-ipofisaria o le infezioni a seguito di meningite batterica o encefalite), la sindrome di Sheehan (necrosi a causa di un flusso sanguigno insufficiente a causa della forte perdita di sangue alla nascita), l'apoplessia ipofisaria e la lesione cerebrale traumatica sono altre importanti cause di ipofunzione ipofisaria8 . È stato dimostrato che l'ipofisi del topo possiede la capacità rigenerativa, essendo in grado di riparare il danno locale introdotto dall'ablazione transgenica delle cellule endocrine 9,10. Le cellule staminali SOX2+ reagiscono acutamente alla lesione inflitta mostrando un fenotipo attivato, caratterizzato da una maggiore proliferazione (con conseguente espansione delle cellule staminali) e da una maggiore espressione di fattori e percorsi correlati alla staminalità (ad esempio, WNT / NOTCH). Inoltre, le cellule staminali iniziano ad esprimere l'ormone ablato, con conseguente ripristino sostanziale della popolazione cellulare impoverita nei successivi (da 5 a 6) mesi 9,10. Inoltre, durante la fase di maturazione neonatale della ghiandola (le prime 3 settimane dopo la nascita), le cellule staminali ipofisarie prosperano in uno stato attivato 6,11,12,13, mentre l'invecchiamento dell'organismo è associato a una ridotta funzionalità delle cellule staminali in situ, a causa di un crescente ambiente infiammatorio (micro-) all'invecchiamento (o 'inflammaging')10,14 . Inoltre, la tumorigenesi nella ghiandola è anche associata all'attivazione delle cellule staminali 7,15. Sebbene l'attivazione delle cellule staminali sia stata rilevata in diverse situazioni di rimodellamento ipofisario (esaminata in 7,16), i meccanismi sottostanti rimangono poco chiari. Poiché gli approcci in vivo (come il tracciamento del lignaggio nei topi transgenici) non hanno fornito un quadro chiaro o completo delle cellule staminali ipofisarie, lo sviluppo di modelli in vitro affidabili per esplorare la biologia delle cellule staminali nell'ipofisi normale e malata è essenziale. La coltura standard in vitro di cellule staminali ipofisarie primarie rimane inadeguata a causa della capacità di crescita molto limitata e delle condizioni non fisiologiche (2D) con rapida perdita di fenotipo (per una panoramica più dettagliata, vedere16). Colture di sfere 3D (pituisfere) sono state stabilite da cellule staminali ipofisarie identificate dalla popolazione laterale e dal fenotipoSOX2+ 2,3,4. Le pituisfere crescono clonalmente dalle cellule staminali, esprimono marcatori di staminalità e mostrano capacità di differenziazione nei tipi di cellule endocrine. Tuttavia, non si espandono considerevolmente mentre mostrano solo una limitata passabilità (2-3 passaggi)3,4. Strutture simili a sfere sono state ottenute anche da cluster di cellule staminali ipofisarie non dissociate quando coltivate in Matrigel diluito al 50% per 1 settimana, ma l'espandibilità non è stata mostrata17. L'approccio della pituisfera è utilizzato principalmente come strumento di lettura per il numero di cellule staminali, ma ulteriori applicazioni sono limitate da una capacità di espansione inferiore16.

Per affrontare e superare queste carenze, è stato recentemente stabilito un nuovo modello 3D, ovvero gli organoidi, a partire dal principale AL endocrino dei topi contenenti MZ e cellule staminali parenchimali. È stato dimostrato che gli organoidi sono effettivamente derivati dalle cellule staminali dell'ipofisi e ricapitolano fedelmente il loro fenotipo18. Inoltre, gli organoidi sono espandibili a lungo termine, pur mantenendo robustamente la loro natura di stelo. Pertanto, forniscono un metodo affidabile per espandere le cellule staminali ipofisarie primarie per un'esplorazione profonda. Tale esplorazione non è realizzabile con il numero limitato di cellule staminali che possono essere isolate da un'ipofisi, che non sono espandibili in condizioni 2D16. È stato dimostrato che gli organoidi sono strumenti preziosi e affidabili per scoprire nuove caratteristiche delle cellule staminali ipofisarie (traducibili in vivo)14,18. È importante sottolineare che il modello organoide rispecchia fedelmente lo stato di attivazione delle cellule staminali ipofisarie che si verifica durante il danno tissutale locale e la maturazione neonatale, mostrando una maggiore efficienza di formazione e replicando percorsi molecolari sovraregolati14,18. Quindi, il modello organoide derivato dall'ipofisi è un modello di ricerca innovativo e potente sulla biologia delle cellule staminali ipofisarie, nonché uno strumento di lettura dell'attivazione delle cellule staminali.

Questo protocollo descrive in dettaglio la creazione di organoidi derivati dall'ipofisi di topo. A tal fine, l'AL è isolato e dissociato in singole cellule, che sono incorporate in Matrigel che imita la matrice extracellulare (di seguito denominata ECM). L'assemblaggio cellulare-ECM viene quindi coltivato in un mezzo definito, contenente essenzialmente fattori di crescita delle cellule staminali e regolatori embrionali ipofisari (ulteriormente denominato "mezzo organoide ipofisario" (PitOM)18; Tabella 1). Una volta che gli organoidi sono completamente sviluppati (dopo 10-14 giorni), possono essere ulteriormente espansi attraverso il passaggio sequenziale e sottoposti a un'ampia esplorazione a valle (ad esempio, immunofluorescenza, RT-qPCR e trascrittomica di massa o monocellulare; Figura 1). A lungo termine, si prevede che gli organoidi delle cellule staminali ipofisarie apriranno la strada agli approcci di riparazione dei tessuti e alla medicina rigenerativa.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali per questo studio sono stati approvati dal Comitato etico per la sperimentazione animale della KU Leuven (P153/2018). Tutti i topi sono stati ospitati presso la struttura per animali dell'università in condizioni standardizzate (temperatura costante di 23 ± 1,5 ° C, umidità relativa 40% -60% e un ciclo giorno / notte di 12 ore), con accesso all'acqua e al cibo ad libitum.

1. Topi

  1. Utilizzare ceppi di topo disponibili in commercio, come i topi C57BL/6J, di età giovane-adulta (8-12 settimane di età). In generale, 2-3 topi forniscono un numero sufficiente di cellule AL per il protocollo.

2. Isolamento e dissociazione dell'AL del topo

NOTA: I medi A, B e C sono preparati in anticipo19,20. Le composizioni sono mostrate nella Tabella 2.

  1. Isolamento dell'AL del mouse
    1. Eutanasia dei topi mediante asfissia di CO2 , seguita da decapitazione (Figura 2A). Lavare le teste dei topi con acqua deionizzata per rimuovere il sangue e spruzzarle con il 70% di EtOH per generare un ambiente sterile.
    2. Utilizzando strumenti chirurgici sterili, rimuovere la pelle della testa tra le orecchie (Figura 2B).
    3. Apri il cranio e rimuovi il cervello.
      1. Rompere il "ponte nasale" (cioè la parte anteriore dell'osso frontale; Figura 2B) con forbici sterili.
      2. Aprire ulteriormente il cranio con le forbici, partendo dal ponte nasale rotto verso le orecchie, su entrambi i lati (Figura 2C).
      3. Rimuovere il cranio e il cervello con una pinzetta sterile, senza toccare la ghiandola pituitaria (Figura 2D).
    4. Rimuovere il diaframma sellae con pinzette smussate, senza danneggiare l'ipofisi. Scartare il PL e l'IL dall'AL sotto uno stereomicroscopio.
      NOTA: PL e IL sono collegati e quindi rimossi contemporaneamente. Queste parti appaiono come tessuto bianco, rispetto all'AL di colore rosa (Figura 2D).
    5. Isolare accuratamente l'AL con pinzette smussate e raccoglierlo in un matraccio Erlenmeyer da 10 ml, riempito con 3 mL di media A (vedere Tabella 2). Mettere il pallone su ghiaccio fino a ulteriore lavorazione.
  2. Dissociazione dell'AL del topo
    1. Rimuovere il mezzo A surnatante (SN) dal matraccio Erlenmeyer contenente l'AL isolato. Aggiungere 2 mL di soluzione di tripsina al 2,5% preriscaldata (37 °C) e incubare a 37 °C per 15 minuti.
    2. Senza rimuovere la soluzione di tripsina, aggiungere 2 mL di soluzione di DNasi preribalta (37 °C) (2 μg/mL nel mezzo A; filtrata sterile attraverso una rete da 0,22 μm) e ruotare il matraccio di Erlenmeyer 10 volte. Lasciare che l'ipofisi affondi sul fondo (~ 1 min) e rimuovere l'SN.
    3. Aggiungere 2 mL di soluzione inibitrice della tripsina preriscaldata (37 °C) (0,1 mg/mL nel mezzo A; filtrata sterile attraverso una rete da 0,22 μm) e incubare a 37 °C per 10 min. Lasciare il sedimento ipofisario sul fondo e rimuovere l'SN.
    4. Aggiungere 2 mL di terreno B preriscaldato (37 °C) (vedi Tabella 2) e incubare a 37 °C per 5 min. Senza rimuovere l'SN, aggiungere 2 mL di terreno C preribalizzato (37 °C) (vedi Tabella 2) e incubare a 37 °C per 15 min.
    5. Lascia che l'ipofisi affondi sul fondo e rimuovi l'SN. Risciacquare l'ipofisi tre volte con il mezzo C preriscaldato (37 °C).
    6. Dissociare l'ipofisi in singole cellule.
      1. Aggiungere 2 mL di C. Aspirare ed espellere più volte la ghiandola pituitaria con una pipetta Pasteur sterile lucidata a fiamma, fino a quando i frammenti non sono più visibili.
      2. Trasferire la sospensione in un tubo da 15 mL con 4,5 mL di soluzione di DNasi preriscaldata (37 °C) (2 μg/mL nel mezzo A; filtrata sterile attraverso una rete da 0,22 μm). Risciacquare l'Erlenmeyer tre volte con 2 mL di mezzo C preriscaldato (37 °C) e trasferire la sospensione nel tubo da 15 mL.
    7. Mescolare la sospensione cellulare raccolta e filtrarla attraverso un filtro cellulare da 40 μm in un tubo da 30 ml. Risciacquare il tubo da 15 mL e il filtro cellulare tre volte con 2 mL di mezzo C e trasferire la sospensione al tubo da 30 mL.
    8. Posizionare la punta di una pipetta pasteur di vetro, riempita con 2 ml di soluzione di albumina sierica bovina al 3% (BSA) (in mezzo A; filtrata sterile attraverso una rete da 0,22 μm), sul fondo del tubo e fuoriuscire delicatamente la pipetta per formare uno strato di densità visibile. Centrifugare a 190 x g per 10 min a 4 °C.
    9. Rimuovere l'SN invertendo il tubo con un movimento fluido e rimuovere le goccioline SN rimanenti con una punta P1000. Risospesso il pellet cellulare in 1 mL di DMEM/F12 avanzato ghiacciato (Adv DMEM/F12) e quantificare le cellule con un contatore cellulare.

3. Stabilimento e coltivazione di organoidi derivati da AL

NOTA: Scongelare ECM sul ghiaccio in anticipo (2-3 ore per 1 mL) e tenerlo sul ghiaccio per tutta la durata del protocollo.

  1. Semina e coltivazione di organoidi
    1. Centrifugare la sospensione cellulare AL a 190 x g per 10 minuti a 4 °C e rimuovere l'SN. Risospesso il pellet di cella in Adv DMEM/F12 utilizzando il volume specifico calcolato per raggiungere una densità di cella di 1,1 x 106 celle/ml.
      NOTA: Ad esempio, se la sospensione cellulare contiene 500.000 cellule/mL, è necessario risospesere il pellet cellulare in 454,54 μL di Adv DMEM/F12 per raggiungere la densità desiderata di 1,1 x 106 celle/mL.
    2. Estrarre il volume di sospensione cellulare necessario per la placcatura (in base al numero desiderato di pozzetti da seminare per lo sviluppo di organoidi) e aggiungere ECM in un rapporto 30:70 (sospensione cellulare al 30% (in Adv DMEM/F12) e al 70% ECM). Mescolare bene pipettando su e giù.
      NOTA: Ad esempio, per una goccia da 30 μL (vedere il punto 3.1.3), si dovrebbe (delicatamente) mescolare 9 μL di sospensione cellulare (contenente ~ 10.000 cellule quando prelevate dalla sospensione 1,1 x 106 celle / mL) con 21 μL di ECM.
    3. Per pozzetto, depositare una goccia di 30 μL della miscela di sospensione cellulare/ECM (vedere punto 3.1.2) su una piastra preriscaldata (37 °C) a 48 pozzetti. Capovolgere la piastra e lasciare solidificare l'ECM a 37 °C per 20 minuti.
      NOTA: Preriscaldare le piastre di coltura per almeno 24 ore a 37 °C.
    4. Riportare la piastra al suo corretto orientamento e aggiungere con attenzione 250 μL di PitOM preriscaldato (37 °C) (vedere Tabella 1) integrato con 10 μM rock inhibitor (Y-27632).
    5. Continuare a coltivare gli organoidi cambiando il mezzo (privo di Y-27632) ogni 2-3 giorni fino a quando gli organoidi non sono completamente cresciuti, il che richiede tra 10-14 giorni (Figura 3A). Quindi, passare gli organoidi.
      NOTA: quando si aspira il mezzo, assicurarsi di non interrompere la cupola ECM. Inclinare leggermente la piastra di coltura e rimuovere il mezzo dal bordo inferiore del pozzo. Il mezzo fresco (preriscaldato a 37 °C) deve essere aggiunto delicatamente sul lato del pozzo. Se le goccioline di gel si scollegano, raccogliere gli organoidi e risospenderli e riprovaccarli in una nuova goccia di ECM.
  2. Passaggio organoide
    1. Aspirare delicatamente il mezzo e aggiungere 400 μL di Adv DMEM/F12 ghiacciato per disintegrare l'ECM e raccogliere gli organoidi in un tubo microcentrifuga. Lavare una volta con 400 μL di Adv DMEM/F12 EM ghiacciato. Centrifugare a 200 x g per 5 min a 4 °C.
    2. Rimuovere accuratamente l'SN e aggiungere 400 μL di enzima TrypLE Express preriscaldato (37 °C) (1X). Mescolare invertendo il tubo più volte e incubare a 37 °C per 5 minuti.
    3. Aggiungere 400 μL di Adv DMEM/F12 ghiacciato e centrifugare a 200 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere l'SN.
    4. Risospesciare il pellet con 100 μL di Adv DMEM/F12 ghiacciato e successivamente rompere gli organoidi tubando vigorosamente su e giù con una punta P200 ristretta (cioè spingere verso il basso la punta vuota contro il fondo del tubo della microcentrifuga, per ridurne il diametro di apertura) fino ad ottenere frammenti organoidi (con un diametro intorno ai 50 μm) (Figura 3B).
      NOTA: La miscela di dissociazione deve contenere prevalentemente frammenti organoidi e solo poche singole cellule. La dura dissociazione degli organoidi in singole cellule influisce negativamente sulla ricrescita degli organoidi.
    5. Aggiungere 800 μL di Adv DMEM/F12 e centrifugare a 190 x g per 10 min a 4 °C. Rimuovere l'SN.
    6. Passare gli organoidi in un rapporto da 1:2 a 1:4. Risospesare il pellet in un volume adeguato di Adv DMEM/F12 come necessario per la placcatura e aggiungere ECM in un rapporto 30:70 (30% sospensione cellulare e 70% ECM). Mescolare bene pipettando su e giù.
    7. Sementi e colture gli organoidi come descritto sopra nei passaggi 3.1.3-3.1.5.
      NOTA: In media, 20 organoidi si sviluppano per pozzetto dalle 10.000 cellule intere di AL seminate (0,2%). Questi organoidi di passaggio 0 possono essere suddivisi in un rapporto 1:2, con conseguente >50 organoidi che si sviluppano per pozzo (passaggio 1). Gli organoidi possono quindi essere suddivisi in un rapporto da 1:2 a 1:4 durante i passaggi successivi. La ricrescita degli organoidi rallenta dopo circa 10 passaggi (corrispondenti a 3 mesi di coltura), concretizzati in organoidi gradualmente sempre meno piccoli.

4. Crioconservazione degli organoidi derivati dall'AL e scongelamento

  1. Crioconservazione degli organoidi
    1. Seguire il protocollo di passaging dal passaggio 3.2.1 fino al passaggio 3.2.5.
    2. Sospendere il pellet organoide (contenente frammenti e cellule) con 1 mL di mezzo di crioconservazione (Tabella 3). Trasferire la sospensione in un crioviale e metterla sul ghiaccio.
      NOTA: Gli organoidi (cioè frammenti e cellule risultanti) da un massimo di quattro pozzetti della piastra a 48 pozzetti possono essere combinati in un unico crioviale.
    3. Mettere i criocerali in un contenitore di congelamento e trasferirli a -80 °C.
    4. Dopo 24 ore, trasferire i campioni in una criobox e conservarli in azoto liquido (-196 °C) per la conservazione a lungo termine.
  2. Scongelamento di organoidi crioconservati
    1. Rimuovere il crioviale dal serbatoio di azoto liquido e metterlo sul ghiaccio. Procedere immediatamente con il protocollo di scongelamento.
    2. Scongelare la soluzione con i frammenti organoidi crioconservati e le singole cellule a 37 °C (bagno d'acqua).
      NOTA: Non conservare la soluzione per più di 2 minuti a 37 °C per evitare la tossicità cellulare da parte del DMSO.
    3. Trasferire il contenuto in un tubo da 15 ml contenente 10 mL di Adv DMEM/F12 ghiacciato con siero bovino fetale al 30% (FBS). Risciacquare il crioviale con 1 mL di Adv DMEM/F12 con il 30% di FBS.
    4. Centrifugare a 190 x g per 10 min a 4 °C. Risospesciare il pellet con 1 mL di Adv DMEM/F12 ghiacciato e trasferire la sospensione in un tubo microcentrifuga.
    5. Centrifugare a 190 x g per 10 min a 4 °C. Risospescere il pellet in un volume adeguato di Adv DMEM/F12 come necessario per la placcatura e aggiungere ECM in un rapporto 30:70. Mescolare bene pipettando su e giù.
    6. Sementi e colture gli organoidi come descritto sopra nei passaggi 3.1.3-3.1.5.

5. Validazione di organoidi derivati da AL

  1. Raccolta e lisi di organoidi per l'isolamento dell'RNA
    1. Raccogliere e centrifugare gli organoidi come descritto sopra (punto 3.2.1).
    2. Rimuovere l'SN e aggiungere 350 μL di tampone di lisi con 1% 2-mercapto-etanolo. Vortice per 30 s e conservare a -80 °C o procedere immediatamente all'isolamento dell'RNA.
      ATTENZIONE: Attenzione che il 2-mercapto-etanolo è un composto tossico. Tutto il lavoro deve essere svolto in una cappa chimica mentre si indossano guanti in nitrile, una maschera antipolvere e occhiali di sicurezza. 2-Mercapto-etanolo può causare danni irreversibili agli occhi e alla pelle.
  2. Fissazione ed incorporamento di organoidi per la colorazione immuno-istochimica/-fluorescenza
    1. Raccogliere e centrifugare gli organoidi come descritto sopra (punto 3.2.1).
    2. Rimuovere l'SN, aggiungere 1 mL di paraformaldeide al 4% (PFA) e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (RT) su uno shaker orbitale (100 rpm).
      ATTENZIONE: il PFA è un noto cancerogeno per l'uomo che può causare danni irreversibili alla cornea. Tutto il lavoro deve essere fatto in una cappa chimica. Guanti in nitrile e occhiali di sicurezza devono essere sempre indossati.
    3. Centrifugare a 200 x g per 5 minuti e rimuovere il SN. Aggiungere 1 mL di PBS, incubare 10 minuti a RT su uno shaker orbitale (100 rpm) e centrifugare a 90 x g per 3 min a 4 °C. Ripetere la fase di lavaggio due volte. Conservare in PBS a 4 °C.
    4. Per la lavorazione dei tessuti e la disidratazione, rimuovere l'SN e aggiungere 150 μL di gel di agarosio al 2% (in PBS) al pellet organoide utilizzando una punta p200 allargata preribalizzata (ottenuta tagliando un piccolo pezzo della punta). Pipettare immediatamente l'intero volume verso l'alto ed espellere nel coperchio del tubo microcentrifuga.
      NOTA: È importante lavorare rapidamente, poiché il gel contenente gli organoidi si solidificherà rapidamente.
    5. Lasciare che il gel solidifichi saldamente per 30 minuti e spostare il disco gel su una cassetta istologica. Immergere e conservare nel 50% di EtOH, fino alla disidratazione nel tissue processor.
    6. Per l'incorporamento di paraffina, posizionare il disco di gel (usando una pinza) in uno stampo di incorporamento e riempire con paraffina calda (60 °C). Posizionare gli stampi a 4 °C fino a quando la paraffina è solida (circa 45 min). Questi campioni possono essere conservati a 4 °C o possono essere immediatamente sottoposti a sezionamento.
    7. Microtomo i blocchi di paraffina contenenti organoidi a 5 μm di spessore e raccogliere i campioni su vetrini. Aggiungere una goccia di acqua deionizzata sotto ogni sezione per consentire il corretto allungamento della sezione e posizionare gli scivoli su una piastra riscaldante piatta a 37 °C durante la notte. Conservare i vetrini con sezioni a 4 °C o continuare direttamente con la colorazione immunoistochimica o immunofluorescenza.

Risultati

Dopo l'isolamento e la dissociazione dell'AL, le singole cellule ottenute vengono seminate in ECM e coltivate in PitOM (Figura 1, Tabella 1). La Figura 3A mostra la coltura cellulare e la densità alla semina (Giorno 0). Alcuni piccoli detriti possono essere presenti (Figura 3A, punte di freccia bianche), ma scompariranno al passaggio. Quattordici giorni dopo la semina, gli organoidi derivati da AL sono completament...

Discussione

Gli organoidi derivati da AL, come descritto qui, rappresentano un potente modello di ricerca per studiare le cellule staminali ipofisarie in vitro. Allo stato attuale, questo approccio organoide è l'unico strumento disponibile per far crescere ed espandere in modo affidabile e robusto le cellule staminali ipofisarie primarie. In precedenza è stato riportato un modello organoide ipofisario derivato da cellule staminali embrionali (ESC) o cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), che ricapitola strettamen...

Divulgazioni

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del KU Leuven Research Fund e del Fund for Scientific Research (FWO) - Fiandre. E.L. (11A3320N) e C.N. (1S14218N) sono supportati da una borsa di dottorato della FWO/FWO-SB.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
48-well plates, TC treated, individually wrappedCostar734-1607
A83-01Sigma-AldrichSML0788
Advanced DMEMGibco12491023
Albumin Bovine (cell culture grade)Serva47330
B-27 Supplement (50X), minus vitamin AGibco12587010
Base mouldsVWR720-1918
Buffer RLTQiagen79216
Cassettes, Q Path MicrotwinVWR720-2191
Cell strainer, 40 µm mesh, disposableFalcon352340
Cholera Toxin from Vibrio choleraeSigma-AldrichC8052
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma-AldrichD5025
D-glucoseMerck108342
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650
DMEM, powder, high glucoseGibco52100039
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mLEppendorf30120086
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slidesThermo Fisher ScientificJ1800AMNZ
Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240VacThermo Fisher Scientific12587976
Ethanol Absolute 99.8+%Thermo Fisher Scientific10342652
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-AldrichF7524
GlutaMAX SupplementGibco35050061
HEPESSigma-AldrichH4034
HEPES Buffer SolutionGibco15630056
InSolution Y-27632Sigma-Aldrich688001
L-Glutamine (200 mM)Gibco25030081
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-FreeCorning15505739
Mr. Frosty Freezing ContainerThermo Fisher Scientific5100-0001
N-2 Supplement (100X)Thermo Fisher Scientific17502048
N-Acetyl-L-cysteineSigma-AldrichA7250
Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic TubesThermo Fisher Scientific375353
Paraformaldehyde for synthesis (PFA)Merck818715
PBS, pH 7.4Gibco10010023
Penicillin G sodium saltSigma-AldrichP3032
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140122
Phenol redMerck107241
Potassium Chloride (KCl)Merck104936
Recombinant Human EGF Protein, CFR&D systems236-EG
Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) ProteinR&D systems234-FSE
Recombinant Human FGF-10Peprotech100-26
Recombinant Human IGF-1Peprotech100-11
Recombinant Human IL-6Peprotech200-06
Recombinant Human NogginPeprotech120-10C
Recombinant Human R-Spondin-1Peprotech120-38
Recombinant Human/Murine FGF-8bPeprotech100-25
Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-TerminusR&D systems464-SH
RNeasy micro kitQiagen74004
SB202190Sigma-AldrichS7067
SeaKem LE AgaroseLonza50004
Sodium Chloride (NaCl)BDH102415K
Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydratePanReac-AppliChemA1047
Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3)Merck106329
Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3)Sigma-AldrichP5280
Stericup-GP, 0.22 µmMilliporeSCGPU02RE
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μmMilliporeSCGP00525
Sterile waterFreseniusB230531
Streptomycin sulfate saltSigma-AldrichS6501
Syringe, with BD Microlance needle with intradermal bevel, 26GBD PlastipakBDAM303176
Thermo Scientific Excelsior ES Tissue ProcessorThermo Scientific12505356
Titriplex IIIMerck108418
TrypL Express Enzyme (1X), phenol redThermo Fisher Scientific12605028
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)Sigma-AldrichT9003
Trypsin solution 2.5 %Thermo Fisher Scientific15090046

Riferimenti

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