Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Chemistry
Das vorliegende Protokoll beschreibt die lösungsmittelbasierte Proteinfällung unter kontrollierten Bedingungen für eine robuste und schnelle Gewinnung und Reinigung von Proteomproben vor der Massenspektrometrie.
Während mehrere Fortschritte in der Massenspektrometrie (MS) die qualitative und quantitative Proteomanalyse verbessert haben, sind zuverlässigere Front-End-Ansätze zur Isolierung, Anreicherung und Verarbeitung von Proteinen vor MS entscheidend für eine erfolgreiche Proteomcharakterisierung. Geringe, inkonsistente Proteinrückgewinnung und Restverunreinigungen wie Tenside sind schädlich für die MS-Analyse. Die Proteinfällung wird im Vergleich zu anderen Probenvorbereitungsstrategien oft als unzuverlässig, zeitaufwendig und technisch anspruchsvoll angesehen. Diese Bedenken werden durch den Einsatz optimaler Proteinausscheidungsprotokolle überwunden. Für die Acetonfällung ist die Kombination von spezifischen Salzen, Temperaturregelung, Lösungsmittelzusammensetzung und Fällungszeit von entscheidender Bedeutung, während die Effizienz der Chloroform-/Methanol-/Wasserfällung von der richtigen Pipettierung und der Manipulation der Durchstechflasche abhängt. Alternativ werden diese Fällungsprotokolle in einer Einweg-Spinkartusche optimiert und halbautomatisch. Die erwarteten Ergebnisse der lösungsmittelbasierten Proteinfällung im konventionellen Format und unter Verwendung einer zweistufigen Einweg-Filtrations- und Extraktionskartusche werden in dieser Arbeit veranschaulicht. Dazu gehört die detaillierte Charakterisierung proteomischer Gemische durch Bottom-up-LC-MS/MS-Analyse. Die überlegene Leistung von SDS-basierten Arbeitsabläufen wird auch im Vergleich zu nicht kontaminiertem Protein demonstriert.
Die Proteomanalyse durch Massenspektrometrie ist aufgrund der verbesserten Empfindlichkeit, Auflösung, Scangeschwindigkeit und Vielseitigkeit moderner MS-Instrumente immer strenger geworden. MS-Fortschritte tragen zu einer höheren Proteinidentifizierungseffizienz und einer präziseren Quantifizierungbei 1,2,3,4,5. Mit verbesserter MS-Instrumentierung fordern die Forscher eine entsprechend konsistente Front-End-Probenvorbereitungsstrategie, die in der Lage ist, hochreine Proteine in kürzester Zeit über alle P....
1. Wesentliche Überlegungen und Probenvorbereitung
Abbildung 4 fasst die erwartete SDS-Erschöpfung nach einer Fläschchen- oder kartuschengestützten Ausfällung von Proteinen in einer Einweg-Filterpatrone unter Verwendung von Aceton zusammen. Die konventionelle Inkubation über Nacht (-20 °C) in Aceton wird mit dem schnellen Acetonfällungsprotokoll bei Raumtemperatur (Schritt 2) sowie der CMW-Niederschlagsmenge (Schritt 4) verglichen. Das Rest-SDS wurde mit dem Methylenblau-Wirkstoff-Assay (MBAS)29 quantifiziert. .......
Eine optimale MS-Charakterisierung wird erreicht, wenn das verbleibende SDS unter 10 ppm erschöpft ist. Während alternative Ansätze wie FASP und Auf-Perlen-Verdauung eine quantitative SDS-Erschöpfung mit variabler Rückgewinnung31,32,33 bieten, besteht das Hauptziel des Niederschlags darin, Reinheit und Ertrag gleichzeitig zu maximieren. Dies hängt davon ab, den Überstand (der das SDS enthält) effektiv zu isolieren, ohne .......
Diese Arbeit wurde vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada finanziert. Die Autoren danken Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Kanada) und SPARC BioCentre (Molecular Analysis) am Hospital for Sick Children (Toronto, Kanada) für ihre Beiträge zur Erfassung von MS-Daten.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acetone | Fisher Scientific | AC177170010 | ≤0.002 % aldehyde |
Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | HPLC grade |
Ammonium Bicarbonate | Millipore Sigma | A6141-1KG | solid |
Beta mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148-25ML | Molecular biology grade |
Bromophenol blue | Millipore Sigma | B8026-5G | Bromophenol blue sodium salt |
Chloroform | Fisher Scientific | C298-400 | Chloroform |
Formic Acid | Honeywell | 56302 | Eluent additive for LC-MS |
Fusion Lumos Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | for analysis of standard protein mixture | |
Glycerol | Millipore Sigma | 356352-1L-M | For molecular biology, > 99% |
Isopropanol | Fisher Scientific | A4641 | HPLC grade |
Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | HPLC grade |
Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75-400-102 | up to 21,000 xg |
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-130 | tapered bottom |
Microcentrifuge Tube (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | rounded bottom |
Micropipette Tips (0.1-10 μL) | Fisher Scientific | 21-197-28 | Universal pipet tip, non-sterile |
Micropipette Tips (1-200 μL) | Fisher Scientific | 07-200-302 | Universal pipet tip, non-sterile |
Micropipette Tips (200-1000 μL) | Fisher Scientific | 07-200-303 | Universal pipet tip, non-sterile |
Micropipettes | Fisher Scientific | 13-710-903 | Micropipet Trio pack |
Pepsin | Millipore Sigma | P0525000 | Lyophilized powder, >3200 units/ mg |
ProTrap XG | Proteoform Scientific | PXG-0002 | 50 complete units per box |
Sodium Chloride | Millipore Sigma | S9888-1KG | ACS reagent, >99 % |
Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher Scientific | 28312 | powdered solid |
timsTOF Pro Mass Spectrometer | Bruker | for analysis of liver proteome extract | |
Trifluoroacetic Acid | ThermoFisher Scientific | L06374.AP | 99% |
Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
Trypsin | Millipore Sigma | 9002-07-7 | From bovine pancreas, TPCK-treated |
Urea | Bio-Rad | 1610731 | solid |
Water (deionized) | Sartorius Arium Mini Water Purification System | 76307-662 | Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm) |
Zinc Sulfate | Millipore Sigma | 307491-100G | solid |
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