Subretinal implantation af RPE på en bærer hos minigrise: retningslinjer for præoperative præparater, kirurgiske teknikker og postoperativ pleje

Summary

Den subretinale implantation af retinal pigmenteret epitel (RPE) er en af de mest lovende tilgange til behandling af degenerative retinale sygdomme. Udførelsen af prækliniske undersøgelser af dyremodeller med store øjne er dog fortsat udfordrende. Denne rapport præsenterer retningslinjer for subretinal transplantation af RPE på en cellebærer til minigrise.

Abstract

Degenerative lidelser i nethinden (herunder aldersrelateret makuladegeneration), der primært stammer fra eller inden for retinal pigmenteret epitel (RPE) lag, fører til en progressiv disorganisering af retinal anatomi og forringelse af visuel funktion. Substitution af beskadigede RPE-celler (RPE'er) med in vitro-dyrkede RPE-celler ved hjælp af en subretinal cellebærer har vist potentiale for at genoprette den anatomiske struktur af de ydre retinale lag og undersøges derfor yderligere. Her præsenterer vi principperne for en kirurgisk teknik, der muliggør effektiv subretinal transplantation af en cellebærer med dyrkede RPE'er til minigrise. Operationerne blev udført under generel anæstesi og omfattede en standard linsebesparende tre-port pars plana vitrektomi (PPV), subretinal anvendelse af en afbalanceret saltopløsning (BSS), en 2,7 mm retinotomi, implantation af en nanofibrøs cellebærer i det subretinale rum gennem en yderligere 3,0 mm sclerotomi, væske-luftudveksling (FAX), silikoneolie tamponade og lukning af alle sclerotomier. Denne kirurgiske tilgang blev brugt i 29 operationer (18 dyr) i løbet af de sidste 8 år med en succesrate på 93,1%. Anatomisk verifikation af den kirurgiske placering blev udført ved hjælp af in vivo fundusbilleddannelse (fundusfotografering og optisk kohærenstomografi). De anbefalede kirurgiske trin til subretinal implantation af RPE'er på en bærer i minipigøjne kan anvendes i fremtidige prækliniske undersøgelser ved hjælp af dyremodeller med store øjne.

Introduction

Aldersrelateret makuladegeneration (AMD) betragtes som hovedårsagen til centralt synstab i udviklede lande og er en af mange tilstande relateret til retinal pigmenteret epitel (RPE) dysfunktion ^1,2. RPE findes på den grundlæggende placerede Bruchs membran (BM) og giver den nødvendige vedligeholdelse af fotoreceptorerne. Den progressive degeneration af RPE-laget er et kendetegn ved den tidlige atrofiske form af AMD, og det ledsager også udviklingen af den sene ekssudative form af AMD. På trods af mange fremskridt inden for behandling af nethindesygdomme er udviklingen af en effektiv behandlingsmodalitet fortsat udfordrende³. En af de lovende metoder er RPE-udskiftning ved hjælp af et in vitro-dyrket RPE-lag. Denne behandling er forbundet med fremskridt inden for stamcelleforskning ved hjælp af human embryonal stamcelleafledt RPE (hESC-RPE) og induceret pluripotent stamcelleafledt RPE (iPSC-RPE)3,4,5,6,7. I de senere år har mange forskergrupper fokuseret på at udvikle forskellige tilgange til RPE-erstatning med det oprindeligt accepterede proof-of-concept 8,9,10,11,12,13,14,15. RPE-cellerne (RPE'er) leveres normalt til det subretinale rum i form af en cellesuspension, et selvbærende celleark eller et cellemonolag understøttet af en kunstig bærer 3,16,17,18,19,20,21. Injektion af en cellesuspension er den nemmeste metode, men BM's kompromitterede tilstand kan ofte forhindre vedhæftning af de transplanterede celler. Dette kan resultere i forkert apicobasal orientering af RPE'erne og manglende dannelse af et monolag^22,23. Den største fordel ved de to andre metoder (dvs. et selvbærende celleark og et cellemonolag understøttet af et kunstigt substrat) er, at cellerne allerede er i en differentieret monolagstilstand, når de implanteres direkte i det subretinale rum²⁴.

Mange kirurgiske teknikker, der beskriver levering af cellebærere i det subretinale rum, er blevet offentliggjort i de senere år 8,9,10,11,12,13,14,15. Disse undersøgelser beskrev brugen af dyremodeller med store øjne, typerne af cellulære bærere, brugen af transplanterede cellulære kulturer, implantationsinstrumenterne samt de kirurgiske teknikker, og forfatterne fokuserede hovedsageligt på resultaterne af subretinal implantation. I 2015 rapporterede Popelka et al. brugen af en rammeunderstøttet ultratynd elektrospundet polymermembran til transplantation af RPE'er i svinekadaverøjne⁸. Den kirurgiske teknik, der er beskrevet her med subretinal implantation af cellebæreren, muliggjorde relativt præcis håndtering af bæreren og nem placering af stilladset i det subretinale rum. Kozak et al. vurderede gennemførligheden af leveringsteknikken for en transportør med en omtrentlig størrelse på 2 mm x 5 mm i svineøjne⁹. Det unikke design af cellebæreren tillod sin korrekte placering, hvilket forhindrede det cellulære monolag i at folde og rynke⁶. Al-Nawaiseh et al. præsenterede først detaljerede trinvise retningslinjer for implantation af subretinale stilladser hos kaniner²⁵. Stanzel et al. offentliggjorde derefter en lignende protokol i 2019 til transplantation hos små gnavere, kaniner, svin og ikke-menneskelige primater²⁶. Som tidligere offentliggjort resulterede transplantationen af et differentieret og polariseret RPE-monolag på en fast bærer i forbedret overlevelse og bedre integration af transplantatet sammenlignet med andre leveringsteknikker (supplerende fil 1)²⁷.

Formålet med alle prækliniske dyreforsøg udført in vivo er at afsløre de forskellige aspekter af kirurgisk transvitreal subretinal implantation af en cellebærer med fokus på proceduresikkerheden, overlevelsen af de transplanterede celler, vævsresponset på de subretinale manøvrer og de kort- og langsigtede postoperative resultater. Anvendelsen af svineøjne som en storøjet dyremodel er blevet rapporteret at være relevant med hensyn til omfanget af de opnåede data, som kan være nyttige og potentielt anvendelige for mennesker^10,11,14. Vores undersøgelse rapporterer den kirurgiske teknik, der anvendes til in vivo subretinal implantation af en cellebærer i en dyremodel med store øjne. Vi præsenterer en detaljeret beskrivelse af de præoperative præparater, den kirurgiske teknik til implantation af subretinal cellebærer og postoperativ pleje af minipigøjnene baseret på vores erfaring gennem de sidste 8 år. Vi beskriver de grundlæggende kirurgiske principper, der kan anvendes til in vivo eksperimentelle undersøgelser, der involverer implantation af forskellige typer celler og cellebærere.

Model med store dyr
Den eksperimentelle besætning af Liběchov minigrise blev grundlagt ved at importere fem dyr fra Hormel-stammen fra USA i 1967. Disse dyr blev krydset til svineblodgruppeundersøgelser med flere andre racer eller stammer: Landrace, Large White, Cornwall, vietnamesiske grise og miniaturesvin af Göttingen oprindelse^28,29. Ved 5 måneders alderen og ca. 20 kg kropsvægt (BW) når minigrisene seksuel modenhed. Overlevelsen af forældrenes minipigracer (Hormel og Göttingen) rapporteres at være 12-20 år. Den subretinale implantation af cellebæreren retter sig mod den centrale del af nethinden. Minigrisenes nethinden mangler en macula og fovea. Det har dog regioner med stærkt koncentrerede keglefotoreceptorer kaldet området centralis og visuelle striber^30,31. Disse regioner er ansvarlige for den højeste synsstyrke.

Operationerne blev udført af fire erfarne vitreoretinale kirurger med hjælp fra en erfaren kirurgisk facilitetsassistent (TA). Før in vivo-forsøgene blev kirurgerne uddannet og opnåede særlig viden om minipig eye anatomi, såsom det lavere forhold mellem linse og glaslegemevolumen, den kortere aksiale længde (15-19 mm), fraværet af Bowmans membran i hornhinden, det mindre glasagtige volumen (2,8-3,2 ml), fraværet af macula og fovea, fraværet af Zinns annulus og den optiske skivediameter (lodret/vandret: 1,5 mm/2,1 mm). I alle tilfælde blev operationen udført under generel anæstesi i et specielt organiseret operationsrum med implementering af standard aseptiske og antiseptiske foranstaltninger.

Protocol

Denne undersøgelse er i overensstemmelse med principperne i retningslinjerne i Helsingfors-erklæringen og etiske principper for medicinsk forskning, der involverer mennesker. Alle forsøg blev udført i henhold til retningslinjerne for pleje og brug af forsøgsdyr og ifølge Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) til brug af dyr i oftalmisk og visuel forskning. Undersøgelsesprotokollen blev godkendt af CAS's udvej professionelle kommission for godkendelse af projekter for forsøg på dyr ved Institut for Dyrefysiologi og Genetik ved det tjekkiske videnskabsakademi (Liběchov, Tjekkiet) (godkendt protokol nr. 60/2016 og nr. 64/2019).

1. Overvejelser under subretinal transplantation af celler på en bærer til minigrise

1. Valg af dyr
   1. Anskaf og brug Liběchov minigrise, der er 12-36 måneder gamle, begge køn og omkring 40-80 kg kropsvægt (BW).
   2. Hold minigrisene indendørs i et klimatiseret dyrehus med temperaturer mellem 18-22 °C, udsættelse for en kunstig 13 t/11 timers lys/mørk cyklus, standardiserede individuelle stier, fri adgang til vand og fodring to gange dagligt.
2. Forberedelse før operationen
   1. Kontroller for øjets kirurgiske orientering og tegn fundusordningerne. For at gøre dette skal du skematisk opdele nethinden på minigrisene på fundustegningen ved hjælp af en pen med en lodret linje ind i temporale (fra synsskiven mod øret), nasale (fra synsskiven mod grisens tryne) og centrale (mellem de store retinale kar på næsesiden) regioner (figur 1A, B).
   2. Vælg kun sunde dyr uden adfærdsmæssig og neurologisk patologi og med normal kvalitet af hud, kropsåbninger, afføring og fødeforbrug. Få en dygtig dyrlæge til at udføre den kliniske observation og udvælge dyrene.
   3. Injicer intramuskulært 3 mg/kg legemsvægt af ceftiofurhydrochlorid (1 ml/kg) på operationsdagen.
3. Præoperativ immunsuppression
   1. Forbered tacrolimus-eluerende polymermikrosfærer som beskrevet i Wang et al. og Sevc et al. ^32,33 med modifikation.
   2. Sørg for, at koncentrationen af tacrolimus i polymermikrosfærerne er 51,3 mg/g bestemt ved HPLC (Table of Materials).
   3. Udfør en subkutan injektion af tacrolimusbelastede polymermikrosfærer i en dosis på 0,25 mg/kg legemsvægt 6 dage før øjenoperationen for at hindre afstødning af celletransplantater. Dette gøres for at sikre overlevelsen af de humane RPE-donorceller under xenogentransplantation i minipigens øjne.
   4. Injicer dyrene intramuskulært på operationsdagen med 80 mg depo-medrol og benzylpenicillin ved 1 ml/10 kg afhængigt af legemsvægten.
4. Anæstesi
   1. Inducer generel anæstesi med en intramuskulær injektion af en blanding af tiletamin (2 mg / kg), zolazepam (2 mg / kg), ketamin (2 mg / kg) og xylazin (0,4 mg / kg) -TKX^34,35 før operationen. Kontroller dybden af anæstesi ved en tilstand af bevidstløshed og ved at kontrollere pedalrefleksen (en knivspids af bagbenets interdigitale hud), hornhinderefleksen (et let strejf af hornhinden), pupilrefleksen (reaktion på lyset) og palpebralrefleksen (et tryk på øjenlåget). Sørg for, at dyret ikke blinker. Bekræft hjerte- og respirationsfrekvensregelmæssigheden.
   2. Efter induktion af anæstesi transporteres det bedøvede dyr til operationsstuen på en elevatorvogn (figur 2A).
   3. Placer dyret på operationsbordet på venstre side for at muliggøre operation på højre øje (figur 2B).
   4. Udfør justeringen af dyrets hoved ved hjælp af styrofoampuder for at opnå den mest passende position af den centrale nethinden til implantation (dvs. vandret og parallelt med gulvet) (figur 2C).
   5. Placer øjendråber af 0,5% proparacainhydrochlorid oftalmisk opløsning i konjunktivalsækken tre gange 1 min fra hinanden for at fremkalde lokalbedøvelse.
   6. Indsæt en venekanyle og intubere dyret med et endotrakealt rør til inhalationsvedligeholdelse af anæstesi (1,5% isofluran) ved hjælp af en anæstesimaskine udstyret med en patientmonitor (figur 2A, B).
   7. Administrer en intramuskulær injektion på 1 ml Eficur pr. 16 kg legemsvægt og 20 mg Depo-Medrol 1 ca. 15 minutter før øjenoperationens begyndelse (materialetabel).
   8. Den fysiologiske kropstemperatur opretholdes ved at dække dyret med isotermisk folie og operationen udføres som beskrevet i punkt 3.
   9. Under operationen skal du overvåge dyrets temperatur sammen med hjertefrekvensen og iltmætningen i blodet ved hjælp af en øreclips og patientmonitor. Undgå at sænke kropstemperaturen til under 38 °C under procedurerne, hvilket betragtes som en sikker grænse³⁶. Oprethold iltmætning (>96%) og pulsfrekvens (70-90 slag pr. Minut) under hele eksperimentet.
   10. Når operationen er afsluttet, skal du slukke for strømmen af isofluran og ekstubere dyret.
   11. Efter spontan vejrtrækning og opvågning overføres dyrene til deres penne.
5. Opsætning af operationsstue
   1. Arranger operationsstuen i henhold til operationens behov på øjnene af dyremodellen med store øjne (figur 3A, B). Juster højden på kirurgens stole samt mikroskopets højde for at opnå en behagelig position for kirurgerne med hensyn til placeringen af grisens snut.

Figur 1: Skematisk tegning af nethindezonerne hos minigrise. A) Skematisk tegning af nethindezonerne i forhold til minigrisens hoved den gule ellipse viser det ønskede område af subretinal implantation, T refererer til det tidsmæssige retinale område, og N refererer til det nasale retinale område. (B) Eksempel på fundusskemaet efter subretinal implantation af cellebæreren (gul) gennem retinotomi (rød). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Transport og anbringelse af dyret . A) Transport af det bedøvede dyr til operationsstuen. B) Anbringelse af dyret under intubation. (C) Justering af dyrets hoved for optimal adgang til den centrale nethinde under operationen (rød pil). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Standardopsætningen på operationsstuen. (A) Skematisk skildring af kirurgernes position (S = kirurg, A = assistent) i forhold til operationsbordets placering med minigrisen, operationsmikroskopet (OM), vitrektomimaskinen (VM), instrumentbordet (IT) og anæstesiologimaskinen (AM). Der er to mulige positioner af vitrektomimaskinen (gul og grå). (B) Virkelige omgivelser på operationsstuen. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Cellebærer, dyrkede cellekulturer og implantationsinjektor

1. Cellebærer
   1. Skær den 30 μm brede ovale ramme med ydre dimensioner på 1,7 mm x 4,8 mm, udstyret med trekantede fremspring asymmetrisk placeret på rammen (figur 4A), fra en bi-aksialt orienteret 36 μm tyk polyethylen-terephthalat (PET) folie ved hjælp af en femtosekundlaser.
   2. Forbered poly(L-lactid-co-DL-lactid) (LLA / DLLA 90/10, MW 868, 270 g / mol) polymeropløsning i pyridin i en koncentration på 11 vægt% med tilsætning af 2,2 μL myresyre pr. 1 g opløsning.
   3. Forbered den nanofibrøse membran med en indlejret understøtningsramme (figur 4B) ved elektrospinding af polymeropløsningen i tre trin⁸: (1) deponer det første lag nanofibre på et siliciumsubstrat, (2) placer rammen på laget og (3) deponer det andet lag nanofibre.
      BEMÆRK: Afsæt hvert lag i 7 minutter for at nå en samlet membrantykkelse på 3,7 μm. Brug følgende parametre til at opnå en membran sammensat af 380 nm tykke fibre og med en gennemsnitlig porestørrelse på 0,4 μm og en porøsitet på ca. 70%³⁷: en 20 G ren stålnål, en spænding på 7,1 kV, et mellemrum på 10 cm, en strømningshastighed på 250 μL / min og en temperatur på 25,0 ° C ± 0,5 ° C.
   4. Fjern forsigtigt membranen med den indlejrede ramme fra siliciumsubstratet og fastgør den til kroppen af en kommerciel 12 brøndcellekulturindsats uden den originale membran for at lette såning og vækst af celler.
   5. Behandl den nanofibrøse membran før cellesåning i luftplasma i 30 s med en effekt på 70 W i en plasmarenser.
2. Cellekulturer, der anvendes til dyrkning på cellebæreren
   BEMÆRK: Følgende cellebærere kan anvendes: 1) nanofibrøse cellebærere uden celler; 2) nanofibrøse cellebærere med primære humane RPE'er (hRPE'er); 3) nanofibrøse cellebærere med humane iPSC-afledte RPE-celler.
   1. Dyrkning af primære hRPE'er
   2. Primære hRPE-celler isoleres fra humane donorøjne i henhold til en tidligere rapporteret teknik³⁸.
   3. Få cellerne ved enzymatisk behandling af nethinden i 30 min. Derefter dyrkes de primære hRPE-celler (passage 0) i op til 2 uger i DMEM / F12 suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS).
   4. Når cellekulturerne når sammenløb, skal du ændre mediet til 1% FBS og kultur i yderligere 30 dage.
   5. Frø de primære hRPE'er på transbrøndplader og på en lamininbelagt nanofibrøs cellebærer med en densitet på 2.000 celler / mm². Efter yderligere 30 dages inkubation i 1% FBS anvendes cellebærerne med primære hRPE'er til subretinal implantation i minigrise.
3. Humane iPSC-afledte RPE'er
   1. Brug hiPSC'er afledt af MERTK-associeret retinitis pigmentosa patientafledte fibroblaster 39, der er genkorrigeret i to alleler ved hjælp af CRISPR/^{Cas9-systemet} (RP1-FiPS4F1-GC2)⁴⁰, samt hiPSC'er afledt af fibroblaster hos et sundt individ (Ctrl2-FiPS5F2)⁴¹ , der bruges som kontrol.
   2. Generer og differentier derefter begge hiPSC'er-cellelinjer mod RPE-celler (hiPSC-RPE) som rapporteret tidligere⁴².
   3. HiPSC-RPE'erne skal have 200.000 celler/^cm2 på lamininbelagte cellekulturindsatser med nanofibrøse membraner af poly(L-lactid-co-DL-lactid) med ovale implantationsrammer i RPE-medium indeholdende knockout DMEM, 20% knockout-serum, 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer, 0,23 mM β-mercaptoethanol, 100 E/ml penicillin, 0,1 mg/ml streptomycin og 10 mM nicotinamid.
   4. Skift mediet hver anden dag, og dyrk hiPSC-RPE i 2 måneder før implantation for at fremme polariseret vækst.
4. Implantationsinjektor
   1. Forbered en plastkapillær med et rektangulært tværsnit på 2,8 mm x 0,8 mm ved blæsestøbning fra et plastrør på OD 1,75 mm / ID 1,10 mm.
   2. Skær et læssevindue på 4 mm x 2,2 mm i plastkapillæret 6 mm fra enden.
   3. Saml injektoren fra plastkapillærrøret, et silikonehåndtag, et stålbladstempel og et stempel (figur 5A).
   4. Bæreren hældes i injektoren gennem et påfyldningsvindue, og skub den senere ud i det subretinale rum med et tryk på stemplet som beskrevet i trin 3.5.2 (figur 5B).
5. Forberedelse af den nanofibrøse bærer og påfyldning af injektoren
   1. Fyld en lille petriskål af plast med 2 ml fosfatbufret saltvand (PBS). Tag en indsats ud med det forberedte cellelag, læg det på en halvblød polystyrenskål, og centrer det under et lysmikroskop. Brug en specialmodificeret stans til at skære holderen ud langs den ovale ramme ved hjælp af et mikroskop. Bærerdimensionerne skal være 2 mm x 5 mm.
   2. Brug en specialfremstillet injektor med flad gennemsigtig slange til ilægning af bæreren; 6 mm fra kapillærens distale ende er der et vindue til lastning af bæreren. Fyld injektorens vindue med PBS.
   3. Brug tangen til at frigøre prøven fra bunden af skålen, løfte den fra væsken og transportere den til injektorens vindue, mens du først kontrollerer sideorienteringsmærkerne på rammen for at detektere oversiden af bæreren med klæbende celler. En oval ramme letter manipulation med transportøren.
   4. Brug en tandsonde (et tandinstrument i rustfrit stål med en skarp ende) til at placere bæreren i injektorens vindue. Brug stemplet til at skubbe holderen ind i den lukkede og sikre øverste del af injektoren. Forbered derefter bæreren til operation.
   5. Kontroller transportørens sideretning ved hvert trin. Fjern den nanofibrøse bærer fra injektoren ved at skubbe metalstemplet.

Figur 4: Nanofibrøs bærer med en indlejret understøttende PET-ramme. (A) Tre synlige mærker på rammen gør det muligt at styre stolens sideretning (hvide pile). (B) Forstørrelsesbillede af PET-rammefragmentet indlejret i cellebærerens nanofibrøse membran (hvide pile). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Implantationsinjektor . (A) Dele af injektoren. B) Nanofibercellebærer med indlejret understøttende PET-ramme belastet til implantationsinjektorens rektangulære kapillær plast. Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Kirurgisk indgreb

1. Kirurgisk udstyr
   1. Brug følgende kirurgiske udstyr: et oftalmisk kirurgisk mikroskop, et operativsystem til operationer på det forreste og bageste øjensegment, et berøringsfrit vitreoretinal kirurgisk system, en laserfotokoagulationsenhed og et digitalt kamera.
      BEMÆRK: Standardparametrene, der anvendes i vitrektomi, exo- og endo-cautery og laserfotokoagulationsudstyr, er afbildet i tabel 1.
2. Kirurgiske instrumenter
   1. Steriliser de genanvendelige kirurgiske instrumenter med en mobil autoklave, dampsterilisator eller lignende i henhold til en standardprotokol. De kirurgiske engangsinstrumenter og materialer, der kræves under operationen, er angivet i materialetabellen.
3. Forberedelse til de kirurgiske trin
   1. Efter bedøvelse af dyret som beskrevet i trin 1.4.1 påføres 1% tropamidopløsning øjendråber og 10% phenylephrinhydrochloridopløsning i konjunktivalsækken 15 minutter før proceduren for at fremkalde lægemiddelinduceret mydriasis.
   2. Gå hen til operationsbordet med kirurgen i den øverste position og assistenten i sidestilling (figur 3).
   3. Barber området omkring øjet med en barbermaskine til engangsbrug, og fjern det ru snavs.
   4. Desinficer konjunktivalsækken med 5% povidon-jodopløsning i 5 min.
   5. Desinficer periorbitalområdet med vatpinde ved at skrubbe fra øjenlågene til periferien. Gentag processen tre gange med en 10% povidon-jodopløsning og lad den virke i 5 minutter.
   6. Dæk operationsfeltet med øjet i midten ved hjælp af en standard steril oftalmisk drapering med klæbrig gennemsigtig folie. Flyt øjenvipperne væk fra øjenkloden. Undgå at skære øjenvipper for at reducere risikoen for postoperativ endophthalmitis.
   7. Indsæt lågspekulumet (Liberman-type eller Cook eye speculum). Fastgør eventuelt niktiteringsmembranen til huden med 8-0 polyglactin sutur.
   8. Åbn bindehinden på næsesiden 2 mm til 3 mm fra limbussen for at udsætte sclera for sclerotomierne ved hjælp af kirurgisk tang og Westcott konjunktival saks.
   9. Indsæt de tre-valvede 25 G trocars 2,5-3 mm fra limbus i området med pars plana (placer dem klokken 7, 10 og 11). Brug roterende bevægelser under indsættelsen på en let skrå måde (100°-110°) mod den bageste nethinde, og hold trokaren med tangen (figur 6).
   10. Hold hornhinden våd eller belæg den med methylcellulose under hele operationen for at forhindre osmotisk hornhindeødem.
4. Pars plana vitrektomi (PPV)
   1. Fjern den midterste del af glaslegemet med standard tre-port pars plana vitrektomi tilgang. Fjern forsigtigt glaslegemet bag linsen i området for den fremtidige store sclerotomi.
   2. Brug en intravitreal 2-4 mg triamcinolonacetonid (TA) injektion (50-100 μL) til at plette den bageste glaslegeme, som normalt forbliver klæbende til nethinden, for at udføre en kontrolleret bageste glaslegemeløsning.
   3. Derefter udføres langsomt en subretinal injektion på 0,05-0,1 ml BSS med en 41 G kanyle mere centralt, idet man undgår dannelsen af en bleb mod periferien.
   4. Reducer de intraokulære trykindstillinger med vandingssystemet ned til 15 mmHg under den subretinale injektion for at forhindre en forbigående retinal vaskulær okklusion.
   5. Udfør en lineær stor endodiatermi af nethinden med en 27 G endodiatermi sonde 3 mm nær næseblæsebasen.
   6. Derefter laves en 3 mm stor retinotomi med et 25 G MVR-blad eller lodret saks med forhøjet intraokulært tryk (IOP) indstilling af vandingssystemet op til 60 mmHg i 3 min til 5 min. Sørg for, at der ikke er blødning fra retinotomi, og reducer derefter IOP til 25 mmHg.
   7. Udfør en eksodiatermi af episkleralkarrene mellem de to næsetrocars 2,5-3 mm fra limbussen med en 27 G endodiatermi sonde ved at påføre en blid berøring på overfladen af sclera.
   8. Kontroller væskeniveauet i infusionsflasken, før du forstørrer sklerotomien, da væskeforbruget efter sklerotomiforstørrelse midlertidigt er højt.
   9. Lav en 3,0 mm stor sclerotomi, 3 mm fra limbussen, ved hjælp af en 2,75 mm phaco kniv.
   10. Vær opmærksom på mulig blødning fra scleralkarrene og ciliarylegemet inde i den store sclerotomi. I tilfælde af blødning skal du bruge en 27 G endodiatermi sonde til at koagulere de beskadigede kar. Forstør sklerotomien til 3,0 mm med en satinkniv for at rumme spidsen af injektoren (0,8 mm x 2,8 mm).
   11. Fjern den prolapsede glaslegeme på stedet for den store sclerotomi med en vitrektor. Oprethold infusionen af BSS i niveauet 25-30 mmHg med vitrektomisystemet for at undgå sammenbrud af kloden.
5. Implantation af cellebæreren
   1. Indsæt forsigtigt injektoren med den dominerende hånd i glaslegemet gennem den store sclerotomi. I tilfælde af modstand skal du forstørre størrelsen af sclerotomien.
   2. Implanter cellebæreren gennem retinotomien ind i det subretinale rum. Brug om nødvendigt en bimanuel teknik med yderligere sclerotomi og lysekronelys for at forbedre implantationens kontrol.
   3. Træk injektoren ud af øjet og luk den store sklerotomi med en 8-0 polyglactin sutur for at undgå komplikationer forbundet med intraokulær hypotoni.
   4. Udfør en komplet væske-luftudveksling (FAX) og dræning af subretinal væske med en kanyle med silikonespids.
   5. Derefter injiceres silikoneolie (1.000 cSt) i glaslegemet ved hjælp af vitrektomisystemet og slangesystemet til injektion af silikoneolie, indtil IOP er normal.
6. Intraoperativ billeddannelse og dokumentation
   1. Udfør en videooptagelse under hele operationen med fotodokumentation af de vigtigste trin i implantationen ved hjælp af et videooptagelsessystem.
   2. Udfyld fundustegningen ved at dokumentere placeringen af sklerotomierne, retinotomi, subretinale implantater og eventuelle komplikationer, der opstod ved hjælp af fundustegningsskemaer.
7. Trin efter operationen
   1. Ved afslutningen af operationen skal du fjerne trokarerne og lukke de tre sclerotomier og bindehinden med 8-0 polyglactin suturer.
   2. Skyl konjunktivalsækken med 5% povidon-jodopløsning.
   3. Udfør en 0,3 ml subkonjunktival injektion af 20 mg gentamicin, 2 mg dexamethason og 2% xylocain.
   4. Kontroller fundusens og objektivets tilstand ved hjælp af en mikroskopisk visning.
   5. Fjern suturen (e) fra niktiteringsmembranen ved hjælp af kirurgisk tang og Westcott konjunktivsaks (valgfrit).
   6. Påfør neomycin salve eller ofloxacin oftalmisk salve i konjunktivalsækken.

Figur 6: Indsættelse af trokarerne i øjet på en minigris. (A) Skematisk afbildning af trokarerne, som indsættes vinkelret på sclera mod midten af glaslegemet i det menneskelige øje (grå farve) og skråt mod den bageste nethinde i minipigøjet (blå farve) for at undgå beskadigelse af linsen. Minipigens linse (blåfarvet) er større end hos mennesker og i forhold til glaslegemets hulrumsstørrelse. (B) Intraoperativ visning af de indsatte trocars i en PPV med tre porte. Hornhinden er dækket af methylcellulose for at forhindre tørring og hævelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

4. Postoperativ pleje

1. Påfør topisk bacitracin zink / hydrocortisonacetat / neomycinsulfat eller 0,3% loxacin i konjunktivalsækken af dyrene fem gange om dagen.
2. Kontroller postoperativt følgende øjenparametre: turgor i øjets bløde væv ved hjælp af palpation, inflammatorisk reaktion på øjenoverfladen og skævhed som en beskyttende reaktion af øjenlågene ved hjælp af en håndholdt spaltelampe eller indirekte oftalmoskop.
3. Til systemisk postoperativ pleje skal du bruge følgende antibiotika:
   1. Intramuskulært ceftiofurhydrochlorid injiceres i en dosis på 3 mg/kg legemsvægt (1 ml/kg) på stabilitetens anden og tredje dag.
   2. Injicer tulathromycin (1 ml/40 kg legemsvægt) efter 72 timer efter operationen til forebyggelse af sekundær bakteriel infektion.
4. Udfør en intramuskulær injektion af flunixin (2 ml/45 kg levende vægt) og tramadolhydrochlorid (100 mg) hver 24. time i 3 dage efter operationen for at forebygge smerter.
5. Opbevar minigrisene i et specialiseret klimatiseret anlæg med et temperaturområde på 18-22 °C og et kunstigt 13 t/11 timers lys/mørkt regime.
6. Sørg for, at de har fri adgang til vand og standardfodring (to gange om dagen).

5. Postoperative procedurer

1. Postoperative oftalmologiske undersøgelser
   1. I den postoperative periode skal du inspicere øjnene med et indirekte oftalmoskop for tilstedeværelse af betændelse (dvs. rødme, vævshævelse eller slimbelastning i konjunktivalsækken). Det intraokulære tryk i det opererede øje måles ved hjælp af palpationsmetoden.
2. Postoperativ billeddannelse
   1. Inducer sedation hos minigrisen ved intramuskulær injektion af en TKX-blanding før fundusfotografering og OCT-undersøgelse. Indsæt 1% tropicamid og 10% phenylephrinhydrochlorid øjendråber i minipigens konjunktivalsæk for at inducere mydriasis.
   2. Brug et lågspekulum for at bevare åbne øjne. For at fugte øjenoverfladen og for at opnå et klart OCT-billede, vask hornhinden af dyret med saltopløsning (0,9% NaCl) hver 30-60 s.
   3. Minigrisen anbringes på operationsbordet på samme måde som under operationen (figur 2B,C, figur 3A). Hovedkravet er at placere hovedet på siden og vinkelret på OCT-enhedens scanningsstykke. Brug styrofoampuder under dyrets snut for at stabilisere hovedet og bringe øjenoverfladen i vandret position.
   4. Indsaml fundusbilleder i farver med et ikke-mydriatisk fundusfarvekamera, da dette gør det muligt at dokumentere det forreste segment, nethinden og den optiske disk. Derudover skal du tage et rødfrit billede af nethinden med det ikke-mydriatiske funduskamera.
   5. Udfør optisk kohærenstomografibilleddannelse ved hjælp af spektraldomænet OCT-systemet. Under OCT- eller fundusbilleddannelsen vippes minigrisens hoved manuelt mod OCT-linserne eller funduskameralinserne for at optimere visningen af den bageste nethinde og implantationsområdet (figur 2C). For optimal billeddannelse af den implanterede bærer på fundus skal du anvende OCT-enhedens infrarøde reflektionslys for at fokusere på implantatet (figur 2C). Brug scanningstilstandene OCT-tværlinje og nethindekort.
   6. Påfør ofloxacin oftalmisk salve ved afslutningen af undersøgelsen under låget af dyrets øje.
   7. Flyt minipigen til indendørsanlægget og observer for dens generelle tilstand indtil afslutningen af sedation (ca. 2 timer til 5 timer).

6. Enucleation af øjet post mortem efter eutanasi

1. Minigrisene bedøves med en intramuskulær injektion af TKX-blandingen efterfulgt af en intravenøs (gennem en 22-G ørekanyle) bolusapplikation på 1% propofol (20 ml / dyr) efterfulgt af ekssanguination. Brug ikke generelle fikseringsmidler.
2. Ofre dyrene ved ekssanguination under dyb generel anæstesi 7 dage, 14 dage, 28 dage og 42 dage efter celletransplantatimplantation.
3. Brug tang og saks til at fjerne de øvre og nedre øjenlåg. Fjern det tredje øjenlåg og skær gennem bindehinden. Skær øjenmusklerne og synsnerven.
4. Enucleate øjnene post mortem ved hjælp af kirurgisk saks og kirurgiske tang. Sørg for, at proceduren udføres af en erfaren person.

Discussion

Subretinal implantation af RPE-celler med forskellig oprindelse er en meget lovende tendens inden for øjenforskning til behandling af retinale degenerative lidelser, såsom AMD 3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,25 . Hovedidéen med denne fremgangsmåde er at erstatte de beskadigede RPE'er med sunde RPE'er, der dyrkes ex vivo (supplerende fil 1)44,45,46,47,48. Brugen af cellebærere til transplantation af de dyrkede RPE-celler repræsenterer den mest rimelige tilgang, da de porøse membraner opretholder det polariserede RPE-cellelag i den korrekte retning med hensyn til det fotosensoriske lag.

Optimal dyremodel
Et kritisk skridt i udviklingen af sådanne behandlingsmetoder er brugen af den optimale dyremodel⁴⁹. Tidligere er små og store dyremodeller blevet brugt, herunder kaniner, hunde, svin og ikke-menneskelige primater 8,9,10,11,12,13,14,15,27,29. I dette papir foreslår vi brugen af Liběchov minipig-modellen og beskriver de præoperative, kirurgiske og postoperative trin, der muliggør robust transplantationseffektivitet. Minigrisen Liběchov blev oprindeligt opdrættet for omkring 20 år siden og er ofte blevet brugt i biomedicinsk forskning inden for neurodegenerative sygdomme, såsom Parkinsons og Huntingtons sygdom^29,50. Da grisen har en relativt stor hjerne med en blodforsyning og immunologisk respons svarende til hos mennesker, er den også blevet brugt som dyremodel til allogene transplantationsforsøg 51,52,53,54. Selvom minigrisenes nethinde ikke har en menneskelignende macula og fovea, indeholder den området centralis og visuelle striber, som er områder af nethinden med en høj koncentration af keglefotoreceptorer³⁰. Den samme størrelse som det menneskelige øje, tilstedeværelsen af en kegleberiget central nethinden, det velbeskrevne immunsystem og tilstedeværelsen af metoder til vurdering af morfologi og funktion efter operationen er vigtige argumenter for brugen af denne store dyremodel i den præsenterede undersøgelse.

Kirurgisk procedure
Så vidt vi ved, er der ingen standardiserede og bredt accepterede kirurgiske teknikker til vitreoretinal transplantation af RPE-celler på bærere. Et af nøglespørgsmålene i celleerstatningsterapi er den udfordrende kirurgiske teknik, der har risiko for intraoperative og postoperative komplikationer forbundet med nethindeløsning, hypotoni, episkleral, choroidal og / eller retinal blødning og høj intraokulær turbulens, hvilket kan føre til stilladsskader. Postoperativt er der risiko for proliferativ vitreoretinopati, endophthalmitis, hypotoni, nethindeløsning og dannelse^af grå stær 4,10,13,14,15.

De første undersøgelser af tilgange, der bruger cellebærere, blev udført hos chinchilla bastard kaniner^13,16,25. Selvom disse dyr repræsenterer en lille dyremodel, var resultaterne med fokus på de tekniske aspekter af operationen afgørende for udviklingen af procedurerne i store dyremodeller og opsummeres derfor nedenfor.

En specialfremstillet 23 G infusionskanyle blev oprindeligt brugt med to sideporte for at omdirigere jetstrømmen, hvilket hjalp med at løse sammenbruddet af bleben og deraf følgende retinal løsrivelse¹³. I denne undersøgelse bemærkede vi ikke noget sådant sammenbrud af bleb. Den mulige årsag til det kunne være den større størrelse af øjeæblet og udførelsen af kernevitrektomien med sparet glaslegeme i periferien på kanyleinfusionsstedet, hvilket kunne reducere kraften i den rettede jetstrøm.

Vanskeligheder under udstødningen af cellebæreren fra instrumentet var en anden intraoperativ hindring i smådyrsmodellerne, som blev kategoriseret som "fanget med instrumentet". Derudover foreslog forfatterne, at det resterende glaslegeme på retinaloverfladen kunne forårsage et baglæns "spring" af bæreren ud af retinotomiåbningen efter implantation. Dette problem kan løses med en enzymassisteret vitrektomi, som muliggør en jævn, kontinuerlig udstødning af cellebæreren i det subretinale rum. I de fleste tilfælde omplacerede forfatterne bæreren for at opnå en fjernere placering af implantatet væk fra retinotomi. I vores case-serie oplevede vi også en situation, hvor cellebæreren forblev fastgjort til spidsen af injektoren. Det blev imidlertid styret ved langsom og skånsom manipulation af lysrøret og injektorens spids. Vi observerede ingen resterende glaslegeme på stedet for retinotomy i nogen af vores tilfælde. Brugen af TA-assisteret PPV i operationerne kan foreslås som en metode til at reducere risikoen for restpåsiddende glaslegeme. Flere farvninger med TA kan være nødvendige for at fjerne det overliggende glaslegeme fuldstændigt.

I en anden undersøgelse blev resultaterne af subretinal implantation af humane RPE-stamceller dyrket som et polariseret cellulært monolag på en polyestermembran rapporteret²⁴. Under forsøgene blev den samme kirurgiske teknik beskrevet tidligere brugt¹³, men en to-port PPV-tilgang blev anvendt. Endelig blev en trin-for-trin protokol for subretinal implantation af cellebærerkirurgi hos kaniner offentliggjort efterfølgende²⁵. Denne undersøgelse præsenterer en meget detaljeret og let gentagelig beskrivelse af den kirurgiske procedure, herunder præoperativ og postoperativ pleje, som også er baseret på tidligere erfaringer.

Under brugen af store dyremodeller i efterfølgende undersøgelser blev ikke kun tekniske spørgsmål behandlet, men også spørgsmål vedrørende immunreaktionen på de transplanterede celler samt cellebærerstørrelsesrelaterede problemer. En undersøgelse med cynomolgusaber (Macaca fascicularis) beskrev resultaterne af subretinal implantation af humane stamcelleafledte RPE-monolag¹⁵. Alle dyrene gennemgik systemisk immunsuppression, som bestod af sirolimus (støddosis på 2 mg, daglig dosis på 1 mg) og tetracyklin (7,5 mg/^kg-BW) startende 7 dage før operationen og varede 3 måneder efter operationen. Den kirurgiske procedure blev udført i henhold til protokoller beskrevet tidligere^24,25. Forfatterne brugte en 25 G tre-port PPV tilgang med lysekrone endo-belysning. Det er vigtigt, at en TA-assisteret PVD blev brugt til at udelukke resterende vitreoretinal adhæsion på den bageste nethinden. Som et supplement til den oprindeligt beskrevne procedure fjernede forfatterne værts-RPE-laget inden for fremtidig implantation ved hjælp af et 20 G specialfremstillet udvideligt loop-instrument.

I vores minigrisestudie brugte vi også systemisk immunsuppression. Imidlertid adskiller typen af immunosuppression sig fra den ovenfor beskrevne. Vi administrerede en subkutan injektion af tacrolimuseluerende polymermikrosfærer som depot i en dosis på 0,25 mg/kg legemsvægt for at hæmme afstødning af celletransplantat og inflammatoriske reaktioner. Vi fjernede ikke værtens RPE-cellelag under operationen, da vores primære mål var at analysere sikkerheden ved proceduren og levedygtigheden af de implanterede celler, men ikke deres integration i værtsnethinden.

Tidligere blev sikkerheden og gennemførligheden af subretinal implantation af et monolag af hESC-afledte RPE'er på en foldbar ikke-nedbrydelig mesh-understøttet submikron parylen-C-membran (6,25 mm x 3,5 mm, 0,4 μm tyk) vurderet hos 14 Yucatán-hungrise¹⁰. Efter dyrkning blev cellerne podet på en maskeunderstøttet membran. Immunsuppression blev udført ved systemisk administration af tacrolimus (intet regime og dosis indikeret) og intravitreale injektioner af 0,7 mg af et dexamethasonimplantat ved operationens afslutning. PPV blev udført med en 20 G tilgang. Forfatterne brugte en intravitreal injektion af triamcinolonacetonid for bedre visualisering af glaslegemet. Den store sklerotomi var 2 mm til 3 mm i størrelse. Efter den subretinale injektion blev nethinden fladt med en midlertidig injektion af perfluorcarbonvæske. Efter væske-luft-udvekslingen blev der udført en silikoneolie tamponade (1.000/5.000 cSt). Postoperativ behandling omfattede okulær anvendelse af dexamethason/neomycin/polymyxin B salve 1 uge efter operationen. Forfatterne rapporterede en succesrate på 91% (dvs. effektiv subretinal implantation og tilstrækkelige postoperative billeddata). I vores undersøgelse blev den intravitreale injektion af TA-krystaller anvendt intraoperativt og hovedsageligt til at visualisere glaslegemet. Imidlertid forbliver den lokale immunosuppressive virkning af dette lægemiddel uklart. De nanofibrøse cellebærere, der blev brugt i vores undersøgelse, var 5,2 mm x 2,1 mm og 3,7 μm tykke med porestørrelser på 0,4 μm. Under operationen udførte vi direkte FAX i stedet for at injicere perfluorcarbonvæske. Vores kirurgiske succesrate (93,1%) var i overensstemmelse med og lidt bedre end Koss et ^al.10.

Den subretinale transplantation af fuldt nedbrydelige cellebærere (stillads) til subretinal implantation blev først undersøgt i 2019 hos Yorkshire grise¹⁴. Undersøgelsen fokuserede primært på de biologisk nedbrydelige egenskaber ved fibrinhydrogelimplantater. Forfatterne bemærkede, at den aggressive immunsuppression, der anvendes på tamsvin, kunne hæmme en lokal inflammatorisk reaktion, der potentielt kunne forårsages under bionedbrydning af fibrinhydrogelimplantaterne. De specificerede imidlertid ikke den immunsuppressive behandling, der blev anvendt til svinene. Under PPV udførte de en 3,6 mm lang sklerotomi til indsættelse af den subretinale implantationsanordning parallelt med og ca. 3,5 mm bageste til limbus. Derudover brugte de et pneumatisk drevet indsprøjtningssystem, der sigter mod at reducere ustabiliteten i håndplaceringen forårsaget af fingermanipulation. I vores case-serie var alle sclerotomierne 2,5 mm til 3,0 mm fra limbussen. Den store sclerotomi til indsættelse af injektoren var 3 mm lang. Den implantationsinjektor, der blev brugt i vores undersøgelse, blev betjent manuelt. Grundig cautery af pars plana i ciliary body og et tilstrækkeligt snit inde i den store sclerotomi synes at være afgørende for at undgå intraoperative komplikationer såsom iatrogen perifer retinal løsrivelse, blødning og tab af implantatet.

Sammenfattende beskriver vi brugen af Liběchov minipig-modellen til transplantation af RPE-celler på biologisk nedbrydelige bærere som en behandlingsmulighed for arvelige og erhvervede nethindesygdomme. Ligheder i øjets anatomi og fysiologi såvel som med hensyn til immunsystemet giver os mulighed for at udvikle og forbedre de kirurgiske teknikker og instrumentering til subretinal implantation af celler, som let kan overføres til behandling af menneskelige øjenlidelser. Det er vigtigt at sikre, at operationer på minigrise udføres ved hjælp af den samme instrumentering (herunder implantationsleveringsværktøjer), når de anvendes i menneskelige operationer, hvilket letter anvendelsen af opnået erfaring og knowhow til mennesker. Alternative dyremodeller med store øjne med tilstedeværelse af et makulært område, såsom ikke-menneskelige primater, kan være nyttige til opfølgning og analyse af de anatomiske og funktionelle ændringer efter subretinal implantation i det centrale retinale område. Den detaljerede beskrivelse af præoperative, kirurgiske og postoperative plejeprocedurer vil være nyttig til fremtidige undersøgelser ved at øge effektiv og standardiseret datagenerering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Technical equipment
Wato EX-65 with a Mindray iMEC10	Mindray, Shenzhen, China	Wato Ex-65	anesthesia machine
R-Evolution CR	Optikon, Rome, Italy	R-Evolution CR	phacoemulsifier/vitrectome
Green laser Merilas 532α	Meridian, Thun, Switzerland	Merilas 532α	ophthalmic green laser
Microscope Hi-R NEO 900A	Haag-Streit Surgical, Wedel, Germany)	Hi-R NEO 900A	ophthalmic surgery microscope
Camera Sony PMW-10MD	Sony, Tokyo, Japan	PMW-10MD	full HD medical 2-piece
Non-contact vitreoretinal surgical system MERLIN BIOM	Volk, Mentor, OH, USA	MERLIN BIOM	BIOM
Steam sterilizer	Tuttnauer Europe B.V., Breda, NL	3870 HSG	sterilizer
iCam100	Optovue, Fremont, CA, USA	iCAM100	funduscamera
iVue OCT100-2	Optovue, Fremont, CA, USA	iVue OCT100-2	OCT
Microsurgical instruments and devices
Cook Eye Speculum	Katena, New Jersey, US	K1-5403	15mm blades
Ophthalmology surgical drape	Hylyard, Alpharetta, Georgie, USA	79304	132 x 142cm
Disposable Two step vitrectomy system. (23 gauge/ 0.6 mm)	DORC, Zuidland, Netherlands	1272.ED06
Infusion line for 23G / 0.6 mm infusion cannula	DORC, Zuidland, Netherlands	1279.P
knife 2.75mm, IQ Geometry Tm Slit Knife Angled, Bevel Up	Surgical Specialties Corporation, Reading, USA	72-2761G
Extendible 41G subretinal injection needle. (23 gauge / 0.6 mm)	DORC, Zuidland, Netherlands	1270.EXT
Omnifix 3ml Luer Lock Solo siringe	BBraun, Melsungen, Germany	4617022V	3ml
1ml soft-inject Tuberculin	Henke Sass Wolf, Tuttlingen, Germany	5010.200V0	1ml
8-0 Coated Vicryl	Ethicon, Puerto Rico, USA	J409G
Purified Silicone Oil (in syringe) 10 ml	(FCI, Paris, France)	S5.7170	1000cSt
Pinnacle 360 Morris Vertical Scissors 23Ga	Synergetics, O'Fallon, USA	10.24.23PIN	23Ga
Revolution DSP 23Ga ILM forceps	Alcon, Geneva, Switzerland	706.44	Griesharber revolution
23ga Straight Laser Probe	Synergetics, O’Fallon, USA	55.21.23
FCI Protect 2.0%	FCI Ophthalmics, Paris, France	S5.9100	viscoelastic
DK Westcott style Stitch Scissors, Curve	Duckworth & Kent, Hertfordshire, England	1-501	Curve
Pierse Notched Forceps, 0,3mm Straigh	Duckworth & Kent, Hertfordshire, England	2-100-1E	0,3mm straigh
DK Harms-Tubingen Straight Tying Forceps	Duckworth & Kent, Hertfordshire, England	2-504E	6mm
DK Needle Holder, Straigh	Duckworth & Kent, Hertfordshire, England	3-201	9mm straigh
Medications and solutions
Unitropic 1% gtt.	UNIMED PHARMA spol. s r.o., Bratislava, Slovak republic	tropicamidum 10 mg/ml	eye drops
Diprophos	Merck Sharp & Dohme B.V., Haarlem, Netherlands	betamethasonum 7 mg/ml	1ml
Alcon BSS Irrigation Solution	Alcon, Geneva, Switzerland	balance salt solution (BSS)	500ml
Betaisodona	Mundipharma, Cambridge, United Kingdom	povidon-Iodine 1g/10ml	30ml
Depo-medrol 120mg	Pfizer, New Yourk, USA	methylprednisolon	5ml/200mg
Shotapen	Virbac Carros Cedex, France	benzylpenicillin, dihydrostreptomycin	250ml
Flunixin a.u.v.	Norbrook, Newry, Northern Ireland	flunixinum 50,0 mg	250ml
Tramal 100MG/2ML	Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschland	tramadol	2ml
Zoletil 100	Virbac Carros Cedex, France	tiletamine, zolazepam	100mg
Narkeran 10	Vetoquinol, Magny-Vernois, France	ketamin	2ml
Rometar 20mg/ml	Spofa pharmaceutica, Prague, Czech republic	xylazinum	20mg
Braunol 75mg/g	B.Braun medical, Prague, Czech republic	povidone iodine	75mg/g
Propofol 1% MCT/LCT	Fresenius Kabi, Bad Homburg, Deutschland	propofol	10mg/1ml
Isoflurane 100% Inhalation vapour, liquid	Piramal Critical Care Limited, West Drayton, United Kingdom	isoflurane	100%
Benoxi gtt.  4mg/1ml	Unimed pharma, Bratislava, Slovakia	oxybuprakaine	10ml
Neosynephrin POS 10% gtt.	Ursapharm , Saarbrücken, Deutschland	fenylefrin chloride	10ml
Ophthalmo-framykoin 1X5GM	Zentiva a.s.,  Prague, Czech republic	bacitracin zinc/hydrocortisone acetate/hydrocortisoneacetate/neomycin sulfate	5mg
Floxal ung.	Dr. Gerhard Mann Chem.-Pharm. Fabrik, Berlin, Germany	ofloxacin	0.30%
Eficur inj.	Hipra, Amer, Spain	ceftiofurum hydrochloridum	50mg / 1ml
Draxxin	Zoetis Inc., New Jersey, USA	tulathromycinum	100mg / 1ml
Tramal	Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschland	tramadoli hydrochloridum	100mg / 2ml
Xylapan	Vetoquinol, Magny-Vernois, France	xylazinum	0.4 mg/kg
Proparacaine hydrochlorid ophthalmic solution 0,5%	Bausch&Lomb Incorporated Tampa, FL, USA	Proparacaine hydrochlorid	0.50%
Prograf	Astellas Pharma, Deerfield, Illinois, USA	Tacrolimus powder	1mg
Cell carrier, cultivated cells cultures, and implantation injector
Falcon Cell Culture Inserts	Corning Inc., Kenneburg, ME, USA	353103
TrypLE Express Enzyme (1X)	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	12604021
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	11320033
Biolaminin 521 LN (LN521)	BioLamina, Sundbyberg, Sweden	LN521-02
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	35050061
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	J66742.0B
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich, San Luis, Mi, USA	P4333
CRALBP	Novus Biologicals, Abingdon, UK	NB100-74392
Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific, Germany	21202