Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

השתלה תת-רשתית של אפיתל פיגמנטי ברשתית (RPE) היא אחת הגישות המבטיחות ביותר לטיפול במחלות רשתית ניווניות. עם זאת, הביצועים של מחקרים פרה-קליניים על מודלים של בעלי חיים בעלי עיניים גדולות נותרו מאתגרים. דו"ח זה מציג הנחיות להשתלה תת-רשתית של RPE על נשא תאים במיני-חזירים.

Abstract

הפרעות ניווניות של הרשתית (כולל ניוון מקולרי הקשור לגיל), שמקורן בעיקר בשכבת האפיתל הפיגמנטי ברשתית (RPE) או בתוכה, מובילות לחוסר ארגון מתקדם של אנטומיה ברשתית ולהידרדרות בתפקוד הראייה. החלפת תאי RPE פגומים (RPEs) בתאי RPE בתרבית חוץ גופית באמצעות נשא תאים תת-רשתית הראתה פוטנציאל לביסוס מחדש של המבנה האנטומי של שכבות הרשתית החיצוניות ולכן נחקרת עוד יותר. כאן, אנו מציגים את העקרונות של טכניקה כירורגית המאפשרת השתלה תת רשתית יעילה של נשא תאים עם RPE מתורבת לתוך minipigs. הניתוחים בוצעו בהרדמה כללית וכללו כריתת PCV סטנדרטית של שלוש יציאות פארס פלנה ויטרקטומיה (PPV), מריחה תת-רשתית של תמיסת מלח מאוזנת (BSS), רטינוטומיה בקוטר 2.7 מ"מ, השתלת נשא תאים ננו-סיבי בחלל התת-רשתית באמצעות סקלרוטומיה נוספת של 3.0 מ"מ, חילופי נוזל-אוויר (FAX), טמפונדה של שמן סיליקון וסגירת כל הטקלרוטומיות. גישה כירורגית זו שימשה ב-29 ניתוחים (18 בעלי חיים) במהלך 8 השנים האחרונות עם שיעור הצלחה של 93.1%. אימות אנטומי של המיקום הכירורגי בוצע באמצעות הדמיה in vivo fundus (צילום פונדוס וטומוגרפיה קוהרנטית אופטית). השלבים הכירורגיים המומלצים להשתלה תת-רשתית של RPE על נשא בעיני מיני-חזיר יכולים לשמש במחקרים פרה-קליניים עתידיים באמצעות מודלים של בעלי חיים בעלי עיניים גדולות.

Introduction

ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD) נחשב הגורם העיקרי לאובדן ראייה מרכזי במדינות מפותחות והוא אחד ממצבים רבים הקשורים לתפקוד לקוי של אפיתל פיגמנטי ברשתית (RPE) 1,2. ה-RPE נמצא על הממברנה של ברוך (BM) הממוקמת בבסיס ומספק את התחזוקה הדרושה לפוטורצפטורים. הניוון המתקדם של שכבת RPE הוא סימן ההיכר של הצורה האטרופית המוקדמת של AMD, והוא מלווה גם את הפיתוח של הצורה האקסודטיבית המאוחרת של AMD. למרות ההתקדמות הרבה בטיפול במחלות רשתית, פיתוח שיטת טיפול יעילה נותר מאתגר3. אחת השיטות המבטיחות היא החלפת RPE באמצעות שכבת RPE בתרבית חוץ גופית. טיפול זה קשור להתקדמות במחקר תאי גזע באמצעות RPE הנגזר מתאי גזע עובריים אנושיים (hESC-RPE) ו- RPE המושרה מתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSC-RPE) 3,4,5,6,7. בשנים האחרונות, קבוצות מחקר רבות התמקדו בפיתוח גישות שונות להחלפת RPE עם הוכחת ההיתכנות המקובלת בתחילה 8,9,10,11,12,13,14,15. תאי RPE (RPEs) מועברים בדרך כלל לחלל התת-רשתית בצורה של תרחיף תאים, יריעת תאים התומכת בעצמה, או חד-שכבה של תא הנתמכת על ידי נשא מלאכותי 3,16,17,18,19,20,21. הזרקת השעיית תאים היא השיטה הקלה ביותר, אך מצבו הנפגע של BM יכול לעתים קרובות למנוע את התקשרות התאים המושתלים. זה יכול לגרום לכיוון אפיקובזאלי שגוי של RPEs וכישלון ליצור monolayer22,23. היתרון העיקרי של שתי השיטות האחרות (כלומר, יריעת תאים התומכת בעצמה וחד-שכבה של תאים הנתמכת על ידי מצע מלאכותי) הוא שהתאים כבר נמצאים במצב חד-שכבתי ממוין כאשר הם מושתלים ישירות בחלל התת רשתית24.

טכניקות כירורגיות רבות המתארות העברת נשאי תאים לחלל התת-רשתית פורסמו בשנים האחרונות 8,9,10,11,12,13,14,15. מחקרים אלה תיארו את השימוש במודלים של בעלי חיים בעלי עיניים גדולות, את סוגי נשאי התאים, את השימוש בתרביות תאים מושתלות, את מכשירי ההשתלה, כמו גם את טכניקות הניתוח, והמחברים התמקדו בעיקר בתוצאות של השתלה תת-רשתית. בשנת 2015, Popelka et al. דיווחו על שימוש בקרום פולימרי אולטרה-דק אולטרה-דק הנתמך על ידי מסגרת להשתלת RPEs לתוך עיני גופה חזיריות8. הטכניקה הניתוחית שתוארה כאן עם השתלה תת-רשתית של נשא התא אפשרה טיפול מדויק יחסית בנשא ומיקום קל של הפיגום בחלל התת רשתית. Kozak et al. העריכו את ההיתכנות של טכניקת המסירה של מוביל עם גודל משוער של 2 מ"מ x 5 מ"מ בעיניים חזיריות9. העיצוב הייחודי של מנשא התאים איפשר את מיקומו הנכון, ומנע מהמונושכבה התאית להתקפל ולהתקמט6. Al-Nawaiseh et al. הציגו לראשונה הנחיות מפורטות שלב אחר שלב להשתלת פיגומים תת-רשתית בארנבים25. שטנצל ועמיתיו פרסמו פרוטוקול דומה בשנת 2019 להשתלה במכרסמים קטנים, ארנבות, חזירים ופרימטים לא אנושיים26. כפי שפורסם בעבר, השתלת שכבה חד-שכבתית RPE מובחנת ומקוטבת על נשא מוצק הביאה לשיפור ההישרדות ולאינטגרציה טובה יותר של השתל בהשוואה לטכניקות מסירה אחרות (קובץ משלים 1)27.

המטרה של כל מחקר פרה-קליני בבעלי חיים המבוצע in vivo היא לחשוף את ההיבטים השונים של השתלה תת-רשתית טרנסוויטריאלית כירורגית של נשא תאים תוך התמקדות בבטיחות ההליך, הישרדות התאים המושתלים, תגובת הרקמה לתמרונים התת-רשתיים והתוצאות קצרות וארוכות הטווח לאחר הניתוח. השימוש בעיניים חזיריות כמודל של בעלי חיים בעלי עיניים גדולות דווח כרלוונטי מבחינת היקף הנתונים המתקבלים, אשר יכולים להיות שימושיים ועשויים להיות ישימים לבני אדם10,11,14. המחקר שלנו מדווח על הטכניקה הכירורגית המשמשת להשתלה תת-רשתית in vivo של נשא תאים במודל של בעלי חיים בעלי עיניים גדולות. אנו מציגים תיאור מפורט של ההכנות לפני הניתוח, הטכניקה הכירורגית של השתלת נשאות תאים תת-רשתית, והטיפול לאחר הניתוח בעיניים הזעירות בהתבסס על ניסיוננו במהלך 8 השנים האחרונות. אנו מתארים את העקרונות הכירורגיים הבסיסיים שניתן להשתמש בהם במחקרי in vivo הכוללים השתלה של סוגים שונים של תאים ונשאי תאים.

מודל בעלי חיים גדולים
עדר הניסויים של מיני חזירי ליבחוב נוסד על ידי ייבוא חמישה בעלי חיים מזן הורמל מארה"ב בשנת 1967. בעלי חיים אלה הוכלאו לצורך מחקרים בקבוצות דם חזיריות עם מספר גזעים או זנים אחרים: Landrace, Large White, Cornwall, Vietnamese Piggs וחזירים מיניאטוריים ממוצא גטינגן28,29. בגיל 5 חודשים ומשקל גוף של כ-20 ק"ג (BW), המיני-חזירים מגיעים לבגרות מינית. הישרדותם של גזעי המיני-חזירים ההורים (הורמל וגטינגן) מדווחת על 12-20 שנה. ההשתלה התת-רשתית של נשא התא מכוונת לחלק המרכזי של הרשתית. הרשתית של המיני-חזירים חסרה מקולה ופוביה. עם זאת, יש לו אזורים של פוטורצפטורים חרוטים מרוכזים מאוד הנקראים אזור centralis ופסים חזותיים30,31. אזורים אלה אחראים לחדות הראייה הגבוהה ביותר.

הניתוחים בוצעו על ידי ארבעה מנתחי זגוגית מנוסים בסיוע עוזר כירורגי מנוסה (TA). לפני ניסויי in vivo למדו המנתחים ורכשו ידע מיוחד באנטומיה של עין המיני-חזיר, כגון לגבי היחס הנמוך בין העדשה לנפח הזגוגית, אורך הציר הקצר יותר (15-19 מ"מ), היעדר קרום באומן בקרנית, נפח הזגוגית הקטן יותר (2.8-3.2 מ"ל), היעדר המקולה והגומה המרכזית, היעדר ביטול צין, וקוטר הדיסק האופטי (אנכי/אופקי: 1.5 מ"מ/2.1 מ"מ). בכל המקרים, הניתוח בוצע בהרדמה כללית בחדר ניתוח מאורגן במיוחד עם יישום אמצעים אספטיים וחיטוי סטנדרטיים.

Protocol

מחקר זה עומד בעקרונות הקווים המנחים של הצהרת הלסינקי ובעקרונות אתיים למחקר רפואי המערב בני אדם. כל הניסויים בוצעו על פי ההנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ועל פי האגודה לחקר הראייה והעיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וחזותי. פרוטוקול המחקר אושר על ידי הוועדה המקצועית של CAS לאישור פרויקטים של ניסויים בבעלי חיים במכון לפיזיולוגיה וגנטיקה של בעלי חיים של האקדמיה הצ'כית למדעים (Liběchov, צ'כיה) (פרוטוקול מאושר מס '60/2016 ומס '64/2019).

1. שיקולים במהלך השתלה תת-רשתית של תאים על נשא למיני-חזירים

  1. בחירת בעלי חיים
    1. להשיג ולהשתמש Liběchov minipigs כי הם 12-36 חודשים, משני המינים, סביב 40-80 ק"ג של משקל הגוף (BW).
    2. החזיקו את המיני-חזירים בתוך הבית בבית חיות ממוזג עם טמפרטורות בין 18-22 מעלות צלזיוס, חשיפה למחזור מלאכותי של 13 שעות / 11 שעות אור/חושך, עטים אישיים סטנדרטיים, גישה חופשית למים והאכלה פעמיים ביום.
  2. הכנה לפני הניתוח
    1. בדוק את הכיוון הכירורגי של העין ולצייר את תוכניות פונדוס. כדי לעשות זאת, חלקו באופן סכמטי את הרשתית של המיני-חזירים בשרטוט הפונדוס באמצעות עט עם קו אנכי לאזורים הרקתיים (מהדיסק האופטי לכיוון האוזן), האף (מהדיסק האופטי לכיוון חוטם החזיר), והמרכזיים (בין כלי הרשתית העיקריים בצד האף) (איור 1A, B).
    2. בחר רק בעלי חיים בריאים ללא כל פתולוגיה התנהגותית ונוירולוגית ועם איכות נורמלית של העור, פתחי הגוף, הצואה וצריכת המזון. בקשו מוטרינר מיומן לבצע את התצפית הקלינית ולבחור את בעלי החיים.
    3. יש להזריק תוך שרירית 3 מ"ג/ק"ג BW של ceftiofur hydrochloride (1 מ"ל/ק"ג) ביום הניתוח.
  3. דיכוי חיסוני לפני הניתוח
    1. הכינו מיקרוספרות פולימריות פולטות טקרולימוס כמתואר ב- Wang et al. ו- Sevc et al. 32,33 עם שינוי.
    2. ודא כי ריכוז הטקרולימוס במיקרוספרות הפולימריות הוא 51.3 מ"ג/גרם כפי שנקבע על ידי HPLC (טבלה של חומרים).
    3. בצע הזרקה תת עורית של מיקרוספרות פולימריות טעונות טקרולימוס במינון של 0.25 מ"ג / ק"ג BW 6 ימים לפני ניתוח העיניים כדי לעכב דחיית השתלת תאים. זה נעשה כדי להבטיח את הישרדותם של תאי תורם RPE אנושיים במהלך השתלה קסנוגנית לתוך העיניים minipig.
    4. יש להזריק לבעלי החיים תוך שרירית ביום הניתוח 80 מ"ג דפו-מדרול ובנזילפניצילין במינון של 1 מ"ל/10 ק"ג בהתאם למשקל הגוף.
  4. הרדמה
    1. יש להשרות הרדמה כללית עם הזרקה תוך שרירית של תערובת של טילטמין (2 מ"ג/ק"ג), זולאזפאם (2 מ"ג/ק"ג), קטמין (2 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (0.4 מ"ג/ק"ג)-TKX34,35 לפני הניתוח. בדוק את עומק ההרדמה על ידי מצב של חוסר הכרה ועל ידי בדיקת רפלקס הדוושה (צביטה של העור הבין-דיגיטלי של הרגל האחורית), רפלקס הקרנית (נגיעה קלה בקרנית), רפלקס האישונים (תגובה לאור) ורפלקס המישוש (נגיעה בעפעף). ודא כי החיה אינה ממצמצת. לאשר את סדירות הלב ואת קצב הנשימה.
    2. לאחר השראת ההרדמה, העבירו את בעל החיים המורדם לחדר הניתוח על עגלת הרמה (איור 2A).
    3. הניחו את החיה על שולחן הניתוחים בצדה השמאלי כדי לאפשר ניתוח בעין ימין (איור 2B).
    4. בצעו את כוונון ראש החיה באמצעות רפידות קלקר כדי להשיג את המיקום המתאים ביותר של הרשתית המרכזית להשתלה (כלומר, אופקית ומקבילה לרצפה) (איור 2C).
    5. יש להניח טיפות עיניים של תמיסת עיניים של 0.5% proparacaine hydrochloride ophthalmic solution לתוך שק הלחמית שלוש פעמים בהפרש של דקה אחת כדי לגרום להרדמה מקומית.
    6. הכניסו צינורית ורידים והכניסו לחיה צינורית אנדוטרכאלית לצורך תחזוקת הרדמה בשאיפה (1.5% איזופלורן) באמצעות מכשיר הרדמה המצויד במוניטור מטופל (איור 2A, B).
    7. יש לבצע הזרקה תוך שרירית של 1 מ"ל אפיקור לכל 16 ק"ג BW ו-20 מ"ג של דפו-מדרול 1 כ-15 דקות לפני תחילת ניתוח העיניים (טבלת חומרים).
    8. לשמור על טמפרטורת הגוף הפיזיולוגית על ידי כיסוי בעל החיים ברדיד איזותרמי ולבצע את הניתוח כמתואר בסעיף 3.
    9. במהלך הניתוח, עקוב אחר חום בעל החיים יחד עם קצב הלב וריווי החמצן בדם באמצעות אטב אוזניים ומוניטור המטופל. הימנע מהורדת טמפרטורת הגוף מתחת ל -38 מעלות צלזיוס במהלך ההליכים, הנחשבים לגבול בטוח36. שמור על ריווי החמצן (>96%) וקצב הדופק (70-90 פעימות לדקה) במהלך כל הניסוי.
    10. כאשר הניתוח הושלם, לכבות את זרימת isoflurane ו extubate החיה.
    11. לאחר נשימה והתעוררות ספונטנית, העבירו את בעלי החיים למכלאות שלהם.
  5. הגדרת חדר ניתוח
    1. סדרו את חדר הניתוח בהתאם לצרכי הניתוח בעיניו של מודל בעל העין הגדולה (איור 3A, B). התאימו את גובה כיסאות המנתחים, כמו גם את גובה המיקרוסקופ, כדי להשיג תנוחה נוחה למנתחים ביחס למיקום חוטם החזיר.

figure-protocol-4758
איור 1: שרטוט סכמטי של אזורי הרשתית במיני-חזירים. (A) שרטוט סכמטי של אזורי הרשתית ביחס לראש המיני-חזיר; האליפסה הצהובה מתארת את האזור הרצוי של השתלה תת-רשתית, T מתייחס לאזור הרשתית הרקתית, ו-N מתייחס לאזור הרשתית באף. (B) דוגמה לסכמת פונדוס לאחר השתלה תת-רשתית של נשא התא (צהוב) באמצעות רטינוטומיה (אדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-5445
איור 2: הובלה ומיקום של החיה . (A) הובלת בעל החיים המורדם לחדר ניתוח. (B) מיקום בעל החיים במהלך אינטובציה. (C) התאמת ראש בעל החיים לגישה מיטבית לרשתית המרכזית במהלך הניתוח (חץ אדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-6026
איור 3: מערך חדר הניתוח הסטנדרטי. (A) תיאור סכמטי של מיקום המנתחים (S = מנתח, A = עוזר) ביחס למיקום שולחן הניתוחים עם המיני-חזיר, מיקרוסקופ הניתוח (OM), מכונת הויטרקטומיה (VM), השולחן האינסטרומנטלי (IT) ומכונת ההרדמה (AM). ישנן שתי תנוחות אפשריות של מכונת הויטרקטומיה (צהוב ואפור). (B) סביבה אמיתית בחדר ניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. נשא תאים, תרביות תאים מתורבתים ומזרק השתלה

  1. מנשא סלולרי
    1. חתכו את המסגרת הסגלגלה ברוחב 30 מיקרומטר עם מידות חיצוניות של 1.7 מ"מ x 4.8 מ"מ, המצוידת בבלטות משולשות הממוקמות באופן א-סימטרי על המסגרת (איור 4A), מרדיד פולי-אתילן-טרפתאלט (PET) דו-אקסיאלי בעובי 36 מיקרומטר באמצעות לייזר פמטו-שניות.
    2. הכן פולי(L-לקטיד-co-DL-לקטיד) (LLA/DLLA 90/10, MW 868, 270 גרם/מול) תמיסת פולימר בפירידין בריכוז של 11 wt% עם תוספת של 2.2 μL של חומצה פורמית לכל 1 גרם של תמיסה.
    3. הכינו את הממברנה הננו-סיבית עם מסגרת תומכת משובצת (איור 4B) על-ידי אלקטרוספינינג של תמיסת הפולימר בשלושה שלבים8: (1) הפקידו את השכבה הראשונה של ננו-סיבים על מצע סיליקון, (2) הניחו את המסגרת על השכבה, ו-(3) הניחו את השכבה השנייה של ננו-סיבים.
      הערה: יש להפקיד כל שכבה למשך 7 דקות כדי להגיע לעובי ממברנה כולל של 3.7 מיקרומטר. השתמש בפרמטרים הבאים כדי לקבל קרום המורכב מסיבים בעובי 380 ננומטר ועם גודל נקבוביות ממוצע של 0.4 מיקרומטר ונקבוביות של כ- 70%37: מחט פלדה של 20 גרם, מתח של 7.1 קילו וולט, רווח של 10 ס"מ, קצב זרימה של 250 מיקרוליטר לדקה, וטמפרטורה של 25.0 ° C ± 0.5 ° C.
    4. הסר בזהירות את הממברנה עם המסגרת המשובצת ממצע הסיליקון וקיבע אותה לגוף של תרבית תאים מסחרית בת 12 בארות ללא הממברנה המקורית כדי להקל על הזריעה והצמיחה של תאים.
    5. טפל בקרום הננו-סיבי לפני זריעת תאים באוויר-פלזמה למשך 30 שניות בהספק של 70 W בשואב פלזמה.
  2. תרביות תאים המשמשות לגידול על נשא התא
    הערה: ניתן להשתמש בנשאי התאים הבאים: 1) נשאי תאים ננו-סיביים ללא תאים; 2) נשאי תאים ננו-סיביים עם RPE אנושי ראשוני (hRPEs); 3) נשאי תאים ננו-סיביים עם תאי RPE אנושיים שמקורם ב-iPSC.
    1. טיפוח hRPE ראשוניים
    2. בודדו תאי hRPE ראשוניים מעיני תורם אנושי על פי טכניקה שדווחה בעבר38.
    3. להשיג את התאים על ידי טיפול אנזימטי של הרשתית במשך 30 דקות. לאחר מכן, טפחו את תאי ה-hRPE הראשוניים (מעבר 0) למשך עד שבועיים ב-DMEM/F12 בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS).
    4. ברגע שתרביות התאים מגיעות למפגש, שנו את המדיום ל-1% FBS ואת התרבית למשך 30 יום נוספים.
    5. זרעו את ה-hRPE הראשוניים על לוחות טרנס-באר ועל נשא תאים ננו-סיביים מצופה למינין בצפיפות של 2,000 תאים למ"מ2. לאחר 30 יום נוספים של דגירה ב-1% FBS, השתמש בנשאי התאים עם hRPE ראשוני להשתלה תת-רשתית במיני-חזירים.
  3. RPE שמקורו בתאי iPSC אנושיים
    1. השתמש ב- hiPSCs שמקורם בפיברובלסטים39 הקשורים לרטיניטיס פיגמנטוזה הקשורים ל- MERTK המתוקנים גנטית בשני אללים באמצעות מערכת CRISPR/Cas9 (RP1-FiPS4F1-GC2)40, כמו גם ב- hiPSCs הנגזרים מהפיברובלסטים של נבדק בריא (Ctrl2-FiPS5F2)41 המשמשים כבקרה.
    2. ליצור ולאחר מכן להבדיל בין שני קווי תאי hiPSCs לכיוון תאי RPE (hiPSC-RPE) כפי שדווח קודם42.
    3. צלחת hiPSC-RPEs ב 200,000 תאים / ס"מ2 על תוספות תרבית תאים מצופות למינין עם ממברנות nanofibrous של poly(L-lactide-co-DL-lactide) עם מסגרות השתלה אליפסה בתווך RPE המכיל DMEM נוקאאוט, 20% סרום נוקאאוט, 0.1 mM חומצות אמינו לא חיוניות, 0.23 mM β-mercaptoethanol, 100 U/mL פניצילין, 0.1 מ"ג / מ"ל סטרפטומיצין, ו 10 mM ניקוטינאמיד.
    4. החליפו את המדיום אחת ליומיים, ותרבו את hiPSC-RPE במשך חודשיים לפני ההשתלה כדי לעודד צמיחה מקוטבת.
  4. מזרק השתלה
    1. הכינו נימי פלסטיק עם חתך מלבני של 2.8 מ"מ x 0.8 מ"מ על ידי ניפוח מצינור פלסטיק של OD 1.75 mm/ID 1.10 mm.
    2. חותכים חלון טעינה של 4 מ"מ x 2.2 מ"מ בנימי הפלסטיק 6 מ"מ מהסוף.
    3. הרכיבו את המזרק מנימי הפלסטיק, ידית סיליקון, בוכנה של להב פלדה ובוכנה (איור 5A).
    4. העמיסו את המנשא לתוך המזרק דרך חלון העמסה ולאחר מכן הוציאו אותו לחלל התת-רשתית על ידי דחיפה של הבוכנה, כמתואר בשלב 3.5.2 (איור 5B).
  5. הכנת המוביל הננו-סיבי והעמסת המזרק
    1. מלאו צלחת פטרי קטנה מפלסטיק ב-2 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS). מוציאים אינסרט עם שכבת התא המוכנה, מניחים אותו על צלחת פוליסטירן חצי רכה ומרכזים אותו תחת מיקרוסקופ אור. השתמש בניקוב מותאם אישית כדי לחתוך את המנשא לאורך המסגרת הסגלגלה באמצעות מיקרוסקופ. מידות המוביל צריכות להיות 2 מ"מ x 5 מ"מ.
    2. השתמש מזרק בהתאמה אישית עם צינורות שקופים שטוחים לטעינת המוביל; 6 מ"מ מהקצה הדיסטלי של הנימים, יש חלון לטעינת המוביל. מלא את חלון המזרק ב- PBS.
    3. בעזרת המלקחיים, שחררו את הדגימה מתחתית המנה, הרימו אותה מהנוזל והעבירו אותה לחלון המזרק תוך בדיקת סימני כיוון הצד על המסגרת תחילה על מנת לזהות את הצד העליון של המוביל עם תאים דבקים. מסגרת אליפסה מאפשרת מניפולציה עם המוביל.
    4. באמצעות בדיקה דנטלית (מכשיר דנטלי מנירוסטה עם קצה חד), מקם את המנשא בחלון המזרק. השתמש בבוכנה כדי לדחוף את המוביל לתוך החלק העליון הסגור והבטוח של המזרק. לאחר מכן, הכינו את המוביל לניתוח.
    5. בדקו את כיוון הצד של המוביל בכל שלב. פרוק את המוביל הננו-סיבי מהמזרק על ידי דחיפת בוכנה המתכת.

figure-protocol-11652
איור 4: נשא ננו-סיבי עם מסגרת PET תומכת משובצת. (A) שלושה סימנים גלויים על המסגרת מאפשרים שליטה בכיוון הצד של המוביל (חיצים לבנים). (B) תצוגת הגדלה של מקטע מסגרת ה-PET המשובץ בקרום הננו-סיבי (חיצים לבנים) של נשא התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-12250
איור 5: מזרק השתלה . (A) חלקים של המזרק. (B) נשא תאים ננו-סיבי עם מסגרת PET תומכת משובצת המוטענת על הנימים המלבניים הפלסטיים של מזרק ההשתלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. הליך כירורגי

  1. ציוד כירורגי
    1. השתמש בציוד הכירורגי הבא: מיקרוסקופ כירורגי אופתלמי, מערכת הפעלה לניתוחים במקטעי העין הקדמית והאחורית, מערכת ניתוחית זגוגית ללא מגע, מכשיר פוטוקואגולציה בלייזר ומצלמה דיגיטלית.
      הערה: הפרמטרים הסטנדרטיים המשמשים בציוד ויטרקטומיה, אקסו ואנדו-צריבה ולייזר פוטוקואגולציה מתוארים בטבלה 1.
  2. כלי ניתוח
    1. לעקר את כלי הניתוח לשימוש חוזר עם מעקר קיטור אוטומטי נייד או דומה על פי פרוטוקול סטנדרטי. כלי הניתוח החד-פעמיים והחומרים הנדרשים במהלך הניתוח מפורטים בטבלת החומרים.
  3. הכנה לשלבי הניתוח
    1. לאחר הרדמת בעל החיים כמתואר בשלב 1.4.1, יש למרוח טיפות עיניים 1% תמיסת טרופיקמיד ותמיסת הידרוכלוריד 10% פנילפרין בשק הלחמית 15 דקות לפני ההליך לעורר מדריזיס הנגרם על ידי תרופות.
    2. התקרבו לשולחן הניתוחים כשהמנתח נמצא בתנוחה העליונה והעוזר בתנוחת הצד (איור 3).
    3. יש לגלח את האזור סביב העין באמצעות סכין גילוח חד פעמי ולהסיר את הלכלוך המחוספס.
    4. יש לחטא את שק הלחמית בתמיסת 5% פובידון-יוד למשך 5 דקות.
    5. לחטא את האזור periorbital עם צמר גפן על ידי קרצוף מן העפעפיים אל הפריפריה. חזור על התהליך שלוש פעמים באמצעות תמיסת 10% פובידון-יוד ולהשאיר למשך 5 דקות.
    6. מכסים את שדה הניתוח עם העין באמצע באמצעות וילון עיניים סטרילי סטנדרטי עם רדיד שקוף דביק. הרחיקו את הריסים מגלובוס העיניים. הימנע חיתוך הריסים כדי להפחית את הסיכון של אנדופתלמיטיס לאחר הניתוח.
    7. הכנס את ספקולום המכסה (מסוג ליברמן או ספקולום עין קוק). לחלופין, לתקן את הקרום nictitating לעור עם 8-0 תפר פוליגלקטין.
    8. פתח את הלחמית בצד האף 2 מ"מ עד 3 מ"מ מהלימבוס על מנת לחשוף את לובן העין לסקלרוטומיות באמצעות מלקחיים כירורגיים ומספריים לחמית ווסטקוט.
    9. הכנס את הטרוקרים 25 G בעלי שלושה שסתומים 2.5-3 מ"מ מהלימבוס באזור הפארס פלנה (מקם אותם בשעה 7, 10 ו -11). השתמשו בתנועות סיבוב במהלך ההחדרה בצורה מעט אלכסונית (100°-110°) לכיוון הרשתית האחורית והחזיקו את הטרוקאר עם המלקחיים (איור 6).
    10. שמור על הקרנית רטובה או לצפות אותה עם methylcellulose במהלך כל הניתוח כדי למנוע בצקת הקרנית אוסמוטית.
  4. Pars plana vitrectomy (PPV)
    1. הסר את החלק האמצעי של גוף הזגוגית בגישה הסטנדרטית של שלוש יציאות pars plana vitrectomy. בזהירות להסיר את הזגוגית מאחורי העדשה באזור של סקלרוטומיה גדולה בעתיד.
    2. השתמש 2-4 מ"ג intravitreal של הזרקת triamcinolone acetonide (TA) (50-100 μL) כדי להכתים את הזגוגית האחורית, אשר בדרך כלל נשאר דבוק הרשתית, על מנת לבצע ניתוק מבוקר של הזגוגית האחורית.
    3. לאחר מכן, לבצע לאט הזרקה תת רשתית של 0.05-0.1 מ"ל של BSS עם צינורית 41 G מרכזי יותר, הימנעות היווצרות של bleb לכיוון הפריפריה.
    4. הפחיתו את הגדרות הלחץ התוך עיני עם מערכת ההשקיה עד 15 מ"מ כספית במהלך ההזרקה התת רשתית על מנת למנוע חסימה חולפת של כלי הדם ברשתית.
    5. בצע אנדודיאטרמיה גדולה ליניארית של הרשתית עם בדיקה אנדודיאטרמית 27 G 3 מ"מ ליד בסיס bleb האף.
    6. לאחר מכן, הכינו רטינוטומיה גדולה בקוטר 3 מ"מ עם להב MVR במשקל 25 גרם או מספריים אנכיים עם הגדרת לחץ תוך עיני מוגבר (IOP) של מערכת ההשקיה עד 60 מ"מ כספית למשך 3 דקות עד 5 דקות. ודא כי אין דימום מן רטינוטומיה, ולאחר מכן להפחית את IOP ל 25 מ"מ כספית.
    7. בצע exodiathermy של כלי הדם episcleral בין שני trocars האף 2.5-3 מ"מ מן הלימבוס עם בדיקה אנדודיאטרמית 27 G על ידי החלת מגע עדין על פני השטח של הסקלרה.
    8. בדוק את רמת הנוזלים של בקבוק העירוי לפני הגדלת סקלרוטומיה, שכן לאחר הגדלת סקלרוטומיה, צריכת הנוזלים גבוהה באופן זמני.
    9. בצע סקלרוטומיה גדולה 3.0 מ"מ, 3 מ"מ מהלימבוס, באמצעות סכין פאקו 2.75 מ"מ.
    10. שימו לב לדימום אפשרי מכלי הדם הסקלרליים והגוף הריסי בתוך הסקלרוטומיה הגדולה. במקרה של דימום, השתמש בדיקה אנדודיאטרמיה 27 G כדי לקרוש את כלי פגום. הגדל את סקלרוטומיה ל 3.0 מ"מ עם סכין סאטן כדי להתאים את קצה המזרק (0.8 מ"מ x 2.8 מ"מ).
    11. הסר את גוף הזגוגית שצנח באתר של סקלרוטומיה גדולה עם ויטרקטור. שמור על עירוי של BSS ברמה של 25-30 מ"מ כספית עם מערכת vitrectomy כדי למנוע קריסת כדור הארץ.
  5. השתלת נשא התא
    1. הכנס בעדינות את המזרק עם היד הדומיננטית לחלל הזגוגית דרך סקלרוטומיה גדולה. במקרה של התנגדות, להגדיל את גודל סקלרוטומיה.
    2. השתילו את נשא התא דרך הרטינוטומיה לתוך החלל התת-רשתית. במידת הצורך, השתמש בטכניקה דו-ידנית עם סקלרוטומיה נוספת ואור נברשת על מנת לשפר את השליטה בהשתלה.
    3. מוציאים את המזרק מהעין וסוגרים את הסקלרוטומיה הגדולה עם 8-0 תפר פוליגלקטין כדי למנוע סיבוכים הקשורים היפוטוניה תוך עינית.
    4. בצע חילופי נוזל-אוויר מלאים (FAX) וניקוז של הנוזל התת-רשתית באמצעות צינורית סיליקון.
    5. לאחר מכן, הזריקו שמן סיליקון (1,000 cSt) לחלל הזגוגית באמצעות מערכת ויטרקטומיה ומערכת צינורות להזרקת שמן סיליקון עד שה- IOP תקין.
  6. הדמיה ותיעוד תוך ניתוחי
    1. בצע הקלטת וידאו במהלך הניתוח כולו עם תיעוד מצולם של שלבי ההשתלה העיקריים באמצעות מערכת הקלטת וידאו.
    2. השלם את ציור הפונדוס על ידי תיעוד המיקום של סקלרוטומיה, רטינוטומיה, שתל תת רשתית, וכל סיבוכים שהתרחשו באמצעות סכימות ציור פונדוס.
  7. שלבים לאחר הניתוח
    1. בסיום הניתוח, להסיר את הטרוקרים ולסגור את שלוש סקלרוטומיות ואת הלחמית עם 8-0 תפרים פוליגלקטין.
    2. יש לשטוף את שק הלחמית בתמיסת פובידון-יוד 5%.
    3. בצע הזרקה תת לחמית של 0.3 מ"ל של 20 מ"ג גנטמיצין, 2 מ"ג דקסמתזון ו-2% קסילוקאין.
    4. בדוק את מצב הפונדוס והעדשה באמצעות תצוגה מיקרוסקופית.
    5. הסר את התפר(ים) מן הממברנה nictitating באמצעות מלקחיים כירורגיים מספריים הלחמית Westcott (אופציונלי).
    6. החל משחה neomycin או משחה אופתלמית ofloxacin לתוך שק הלחמית.

figure-protocol-18308
איור 6: החדרת הטרוקרים לעין של מיני-חזיר. (A) תיאור סכמטי של הטרוקרים, המוחדרים בניצב ללובן העין לכיוון מרכז חלל הזגוגית בעין האנושית (צבע אפור) ובאופן אלכסוני לכיוון הרשתית האחורית בעין המיני-חזירית (צבע כחול) כדי למנוע נזק לעדשה. עדשת המיני-חזיר (בצבע כחול) גדולה מזו שבבני אדם ויחסית לגודל חלל הזגוגית. (B) תצוגה תוך-ניתוחית של הטרוקרים שהוכנסו ב-PPV בעל שלוש יציאות. הקרנית מכוסה במתילצלולוז למניעת ייבוש ונפיחות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. טיפול לאחר הניתוח

  1. יש למרוח אבץ/הידרוקורטיזון אצטט/נאומיצין סולפט או 0.3% של אבץ בציטרסין על שק הלחמית של בעלי החיים חמש פעמים ביום.
  2. לאחר הניתוח, בדוק את הפרמטרים הבאים של העין: טורגור של הרקמות הרכות של העין באמצעות מישוש, תגובה דלקתית על פני העין, פזילה כתגובה מגנה של העפעפיים באמצעות מנורת סדק ידנית או אופטלמוסקופ עקיף.
  3. לטיפול מערכתי לאחר הניתוח, השתמש באנטיביוטיקה הבאה:
    1. הזריקו הידרוכלוריד ceftiofur תוך שרירי במינון של 3 מ"ג / ק"ג BW (1 מ"ל / ק"ג) ביום השני והשלישי של יציבות.
    2. הזריקו טולתרומיצין (1 מ"ל/40 ק"ג BW) לאחר 72 שעות לאחר הניתוח למניעת זיהום חיידקי משני.
  4. בצע הזרקה תוך שרירית של פלוניקסין (2 מ"ל / 45 ק"ג של משקל חי) ו tramadol hydrochloride (100 מ"ג) כל 24 שעות במשך 3 ימים לאחר הניתוח כדי למנוע כאב.
  5. שמור את המיני-חזירים במתקן ממוזג מיוחד עם טווח טמפרטורות של 18-22 מעלות צלזיוס ומשטר אור / חושך מלאכותי של 13 שעות / 11 שעות.
  6. ודא שיש להם גישה חופשית למים והאכלה סטנדרטית (פעמיים ביום).

5. הליכים לאחר הניתוח

  1. בדיקות עיניים לאחר הניתוח
    1. בתקופה שלאחר הניתוח, לבדוק את העיניים עם אופטלמוסקופ עקיף לנוכחות של דלקת (כלומר, אדמומיות, נפיחות רקמות, או גודש ריר בשק הלחמית). למדוד את הלחץ התוך עיני בעין המנותחת באמצעות שיטת המישוש.
  2. הדמיה לאחר הניתוח
    1. יש לגרום להרגעה במיני-חזיר על ידי הזרקה תוך שרירית של תערובת TKX לפני צילום פונדוס ובדיקת OCT. להחדיר 1% tropicamide ו 10% phenylephrine hydrochloride טיפות עיניים לתוך שק הלחמית של minipig על מנת לגרום mydriasis.
    2. השתמשו בספקולום מכסה כדי לשמור על עיניים פקוחות. ללחות פני העין ולקבלת תמונת OCT ברורה, שטפו את הקרנית של בעל החיים בתמיסת מלח (0.9% NaCl) כל 30-60 שניות.
    3. מקמו את המיני-חזיר על שולחן הניתוחים באותו אופן כמו במהלך הפעולה (איור 2B,C, איור 3A). הדרישה העיקרית היא למקם את הראש בצד ובניצב לחתיכת הסריקה של מכשיר ה- OCT. השתמש רפידות קלקר מתחת לחוטם של החיה כדי לייצב את הראש, להביא את פני השטח של העין למצב אופקי.
    4. אספו תמונות פונדוס צבעוניות באמצעות מצלמת פונדוס צבעונית שאינה מידריאטית מכיוון שהדבר מאפשר תיעוד של המקטע הקדמי, הרשתית והדיסק האופטי. בנוסף, צלם תמונה ללא אדום של הרשתית עם מצלמת פונדוס שאינה מידריאטית (non-mydriatic fundus).
    5. בצע הדמיית טומוגרפיה קוהרנטית אופטית באמצעות מערכת OCT בתחום הספקטרלי. במהלך הדמיית OCT או פונדוס, הטו את ראש המיני-חזיר באופן ידני לכיוון עדשות OCT או עדשות מצלמת פונדוס כדי למטב את שדה הראייה של הרשתית האחורית ואזור ההשתלה (איור 2C). להדמיה אופטימלית של המוביל המושתל על הפונדוס, השתמשו באור האינפרא-אדום המוחזר של מכשיר ה-OCT כדי להתמקד בשתל (איור 2C). השתמש במצבי OCT crossline ו- retina map scanning.
    6. החל משחה אופתלמית ofloxacin בסוף הבדיקה מתחת למכסה העין של החיה.
    7. העבר את המיניחזיר למתקן המקורה והתבונן במצבו הכללי עד סוף ההרגעה (כשעתיים עד 5 שעות).

6. Enucleation של העין לאחר המוות לאחר המתת חסד

  1. הרגיעו את המיניחזירים עם הזרקה תוך שרירית של תערובת TKX ואחריה יישום בולוס תוך ורידי (דרך צינורית אוזניים 22-G) של 1% פרופופול (20 מ"ל / חיה) ואחריו exsanguination. אין להשתמש בקיבועים כלליים.
  2. הקריבו את בעלי החיים על ידי הרדמה כללית עמוקה 7 ימים, 14 ימים, 28 ימים ו-42 ימים לאחר השתלת התא.
  3. השתמש במלקחיים ובמספריים כדי להסיר את העפעפיים העליונים והתחתונים. הסירו את העפעף השלישי וחתכו דרך הלחמית. לחתוך את שרירי העין ואת עצב הראייה.
  4. לחנך את העיניים לאחר המוות באמצעות מספריים כירורגיים ומלקחיים כירורגיים. ודא כי ההליך מבוצע על ידי אדם מנוסה.

Representative Results

תוצאות ההשתלה התת-רשתית של נשא התא במיני-חזירים של Liběchov מוצגות ב- Table 2. השתלה מוצלחת הוגדרה כהשגת נתונים מספיקים למחקר היסטולוגי ואימונוהיסטוכימי. מקרים כושלים הוגדרו כעיניים עם סיבוכים תוך ניתוחיים חמורים, מה שהפך תצפית נוספת על רקמות העין לבלתי אפשרית.

יישום הטכניקה המוצעת עם שימוש בטמפונדה משמן סיליקון מאפשר לשלוט במצב ההשתלה התת-רשתית באמצעות שיטות הדמיה החל מהיום הבא לאחר הניתוח ועד לזמן ההשתלה (איור 7, איור 8 ואיור 9).

הדמיית פונדוס ו-SD-OCT
המיני-חזירים נבדקו בתקופה שלאחר הניתוח באמצעות הדמיית פונדוס, הדמיה ללא אדום וטומוגרפיה אופטית קוהרנטית בתחום הספקטרלי (איור 7). הדמיית פונדוס באיכות גבוהה התאפשרה באמצעות שימוש במדיה אופטית שקופה, כולל עדשה שקופה ושימוש בטמפונדה משמן סיליקון (איור 7A). האתר של רטינוטומיה לא הראה סימנים של תגובת שגשוג (איור 7A, חיצים צהובים), ומסגרת PTE של נשא התא נראתה בבירור דרך השכבות השקופות למחצה של הרשתית החזירית. בהדמיה נטולת אדום, ההחזרה של hRPE המתורבתים על הנשא לא הייתה שונה מההשתקפות של שכבת RPE חזירית אנדוגנית (איור 7B). ב-SD-OCT, מסגרת ה-PTE גרמה רק להצללה קלה של המבנים האנטומיים שמתחתיה ולהתעבות קלה של הרשתית (איור 7C, חיצים אדומים). לא הבחינו באזורים היפו-רפלקטיביים או היפר-רפלקטיביים לא טיפוסיים ב-SD-OCT, ונראה שגם קרום הברוך נותר ללא פגע. איור 8 מציג תמונות פונדוס ו-iOCT של פיגום מעובד עם תאי RPE אנושיים ראשוניים חודש לאחר הניתוח (איור 8). נשא התאים עצמו (ללא תאים) לא גרם לעלייה משמעותית בעובי הרשתית (איור 9C). ממצאים אלה מצביעים על כך שההשפעה היאטרוגנית התוך ניתוחית של השתל הייתה מינימלית וכי נשא התאים המושתלים עבר התאמה מספקת של התאים המושתלים לתאי קולטני האור ולרקמת הרשתית העצבית.

figure-representative results-2113
איור 7: הדמיה לאחר הניתוח של הרשתית במיני-חזירים . (A) הדמיית פונדוס, (B) תמונה נטולת אדום, ו-(C) הדמיית טומוגרפיה קוהרנטית אופטית של נשא ננו-סיבי עם תאי RPE אנושיים ראשוניים במעקב של שבוע לאחר השתלה תת-רשתית בעין מיני-חזירית. (A) החיצים הצהובים מציינים את אתר הרטינוטומיה. (B) חיצים אדומים מדגימים את השוליים של נשא התא הננו-סיבי. (C) החיצים האדומים מראים את הצללה קלה של אות OCT הנגרמת על-ידי מסגרת ה-PET התומכת של המוביל הננו-סיבי, שהושתל בחלל התת-רשתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-representative results-3020
איור 8: הדמיית פונדוס ותמונות iOCT של הפיגומים 30 יום לאחר ההשתלה התת-רשתית במיני-חזירים. A, B, C, D ו-E מתאימים לחזירים 169, 182, 179, 199 ו-224, בהתאמה. החיצים הצהובים מתארים את מסגרת הפיגומים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ניתוח היסטולוגי ואימונוהיסטוכימי
לאחר המתת החסד של בעלי החיים, עיני מיני-חזיר שלמות הוסרו וקיבעו ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 24 שעות. החלק הקדמי של העין הוסר, והנשא הננו-סיבי המושתל זוהה ברשתית המרכזית של האף ובודד עם לובן העין מחובר. כל הרקמות היו מוגנות בהקפאה בתמיסות סוכרוז מדורגות, ונחתכו קטעים קפואים אנכיים, כמתואר בפירוט43. היסטולוגיה של הממברנה הננו-סיבית, ללא תאי RPE, לאחר 4 שבועות של השתלה, גילתה רשתיות ללא דלקת ושינויים ניווניים (איור 9A). נוכחות הממברנה הננו-סיבית זוהתה באור מקוטב (איור 9B).

figure-representative results-4288
איור 9: ניתוח היסטולוגי של הממברנה הננו-סיבית-אצלולרית המושתלת. צביעת Hematoxylin-eosin של קרום ננו-סיבי אצלולרי 4 שבועות לאחר ההשתלה (A) עם תאורה סטנדרטית ו-(B) עם מיקרוסקופ אור מקוטב. החץ הלבן מציין את לוקליזציה של קרום ננו-סיבי (סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר). (C) תמונות טומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית In vivo של הממברנה הננו-סיבית האצלולרית לאחר 4 שבועות לאחר ההשתלה מתארות קבלה והיצמדות טובה של הממברנה הננו-סיבית, בחלל התת-רשתית. החץ הלבן מציין את מיקום השתל בתמונת החתך של הרשתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 10 מראה את צביעת המטוקסילין-אאוזין (H&E) של אזור הרשתית המכיל את תאי ה-hRPE הראשוניים המושתלים על נשא ננו-סיבי (חץ צהוב) בעין המיני-חזירית. המראה הפיגמנטי של hRPE הראשוניים המושתלים יצר שכבת פיגמנט רציפה אך לא סדירה (איור 10, חיצים אדומים). לאחר תקופות תצפית ארוכות יותר (6 שבועות), הרשתית העצבית מתחת לשתלים הראתה מראה דמוי רוזטה או תגובה היפרטרופית סביב אתר הרטינוטומיה, ככל הנראה כתוצאה ממניפולציה יאטרוגנית. תוצאות מורפולוגיות אלה דומות לממצאי SD-OCT ותומכות בראיות להשפעה המינימלית של נשאות על רקמת הרשתית.

figure-representative results-5802
איור 10: ניתוח היסטולוגי של הממברנה הננו-סיבית המושתלת עם hRPE הראשוני. צביעת Hematoxylin-eosin באזור הרשתית המכיל את המוביל הננו-סיבי המושתל (חץ צהוב) עם hRPE ראשוני בעין המיני-חזירית. החיה עברה המתת חסד ונותחה 6 שבועות לאחר ההשתלה. ניתן היה להבחין בבירור בין hRPE הראשוניים על ידי גודלם, צורתם העגולה והפיגמנטציה (חיצים אדומים) בחלל התת-רשתית מול הפוטורצפטורים. גרעיני הפוטורצפטורים ב-ONL בונים מבנים דמויי רוזטה. החלל התת-רשתית נראה היפרטרופי. קיצורים: hRPE = אפיתל פיגמנטי רשתית אנושי ראשוני, ONL = שכבה גרעינית חיצונית, INL = שכבה גרעינית פנימית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Immunostaining בוצע בשיטה עקיפה דו-שלבית. המקטעים הודגרו בטמפרטורת החדר למשך הלילה ב-CRALBP, נוגדן ראשוני חד-שבטי, בדילול של 1:100. Immunofluorescence בוצע באמצעות נוגדן משני מצומד Alexa Fluor 488.

ה-hRPE הראשוניים המושתלים היו נוכחים באזור ההשתלה וביטאו את סמן RPE CRALBP טיפוסי בדומה לתאי RPE מיני-חזיריים אנדוגניים (איור 11A). לעומת זאת, נראה שהמורפולוגיה של התאים המושתלים לא קיבלה צורה חד-שכבתית לאחר ההשתלה, אלא נשארה ממוקמת בתוך החלל התת-רשתית המוגדר (איור 11A,B, חיצים לבנים). הסמנים הבאים של RPE/רשתית והמראה המורפולוגי נותרו חיוביים לאחר 6 השבועות שלאחר ההשתלה: נוכחות של גרגרי פיגמנט/מלנין, הסמנים העצביים הספציפיים לרשתית בשלב הסופי עבור המוט הדו-קוטבי (PKC-alpha) והפוטורצפטורים של החרוט (PNA), והחיוביות של GFAP - סימן להפעלת מיקרוגליה.

figure-representative results-7586
איור 11: תיוג חיסוני עם סמן תאי RPE CRALBP (חלבון קושר רטינאלדהיד תאי) במיני-חזיר 6 חודשים לאחר ההשתלה של hRPE ראשוני. (A) חלקים מוקפאים אנכיים של עין החזיר שטופלה סומנו בנוגדן חד-שבטי CRALBP (ירוק) ומוכתמים נגדית ב-DAPI (כחול). (B) תיאור יחיד של תיוג גרעיני תאים עם DAPI בשחור-לבן, כאשר ניגודיות גבוהה חושפת את הצורה העגולה של תאי hRPE בודדים (חלקם מוצגים עם חצים לבנים). קיצורים: hRPE = אפיתל פיגמנט ברשתית האדם, ONL = שכבה גרעינית חיצונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

סיבוכים עיניים
בסך הכל, היו 27 מתוך 29 (93.1%) פעולות שבוצעו בהצלחה. ההגדרה "ניתוחים שבוצעו בהצלחה" הוחלה על אותם מקרים שבהם העין המנותחת לא הראתה סיבוכים משמעותיים מבחינה קלינית לאחר הניתוח עד למועד הניתוח שיכולים להשפיע על המחקר ההיסטולוגי והאימונוהיסטוכימי. שקיפות מופחתת של המדיה האופטית השפיעה על ההדמיה שלאחר הניתוח בארבעה מקרים (13.7%); עם זאת, עיניים אלה עובדו עם ניתוח היסטולוגי ואימונוהיסטוכימי נוסף.

היפרדות רשתית היקפית תוך ניתוחית התרחשה בארבעה מקרים (13.8%). בשני מקרים, זה נוהל על ידי שאיפה של הנוזל subretinal במהלך חילופי נוזל גז ויישום של photocoagulation לייזר של הרשתית באזור ניתוק. בשני המקרים האחרים (6.9%) ניתוק הרשתית היה קשור לדימום מסיבי ברשתית ותת רשתית, מה שהפך את השתלת נשא התאים לבלתי אפשרית והוביל להפסקת הניתוח ולהמתת חסד מיידית של המיניחזיר בעודו על שולחן הניתוחים.

לאפרמטריםהגדרות רגילות בשימוש
1מהירות ויטרקטומיה (קצב חיתוך)עד 20,000 חיתוכים לדקה
2משאבת ונטורי50-180 מ"מ כספית
3זמן עלייה1 שניות
4לחץ השקיה18-25 מ"מ כספית
5לחץ עירוי אוויר20-25 מ"מ כספית
6אקסודיאתרמיה דו קוטבית18-26%
7אנדודיאטרמיה מונופולרית16-18%
8פוטוקואגולציה בלייזר של הרשתית, 532 ננומטרהספק 100-150 mW
מרווח 100 מטר/שניה
משך: 100 מטר/שניה

טבלה 1: פרמטרים סטנדרטיים המשמשים במהלך ויטרקטומיה ופוטוקואגולציה בלייזר.

סה"כ בעלי חיים, n18
סה"כ עיניים, n36
עיניים מנותחות, n29
השתלה מוצלחת, n27
מקרים שנכשלו, n2
זמן ניתוח ממוצע, דקה57
שיעור הצלחה, %93.1

טבלה 2: תוצאות הטכניקה הכירורגית הסטנדרטית עם השתלה תת-רשתית של נשא התאים במיני-חזירים של ליבחוב בין השנים 2016 ל-2020.

קובץ משלים 1: סיכום המחקרים המוקדשים להשתלה תת-רשתית של תאי RPE על נשא התא. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

השתלה תת-רשתית של תאי RPE ממקורות שונים היא מגמה מבטיחה מאוד בחקר העיניים לטיפול בהפרעות ניווניות ברשתית, כגון AMD 3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,25 . הרעיון המרכזי של גישה זו הוא להחליף את RPE פגום עם RPEs בריאים תרבית ex vivo (קובץ משלים 1)44,45,46,47,48. השימוש בנשאי תאים להשתלת תאי RPE מתורבתים מייצג את הגישה הסבירה ביותר, שכן הממברנות הנקבוביות שומרות על שכבת תאי RPE המקוטבת בכיוון הנכון ביחס לשכבה הפוטו-חושית.

מודל אופטימלי לבעלי חיים
שלב קריטי בפיתוח גישות טיפול כאלה הוא השימוש במודל החייתי האופטימלי49. בעבר נעשה שימוש במודלים של בעלי חיים קטנים וגדולים, כולל ארנבות, כלבים, חזירים ופרימטים לא אנושיים 8,9,10,11,12,13,14,15,27,29. במאמר זה, אנו מציעים את השימוש במודל Liběchov minipig ומתארים את השלבים לפני הניתוח, הניתוח ולאחר הניתוח המאפשרים יעילות השתלה איתנה. המיני-חזיר Liběchov גודל במקור לפני כ -20 שנה ונמצא בשימוש תכוף במחקר ביו-רפואי בתחום מחלות נוירודגנרטיביות, כגון פרקינסון ומחלת הנטינגטון29,50. מכיוון שלחזיר יש מוח גדול יחסית עם אספקת דם ותגובה חיסונית דומה לאלה שבבני אדם, הוא שימש כמודל בבעלי חיים גם לניסויי השתלות אלוגניות51,52,53,54. אף על פי שהרשתית של המיני-חזירים אינה בעלת מקולה וגומה דמוית אדם, היא מכילה את האזור המרכזי ואת הפסים החזותיים, שהם אזורים ברשתית עם ריכוז גבוה של פוטורצפטורים חרוטים30. הגודל הדומה לעין האנושית, נוכחותה של רשתית מרכזית מועשרת בחרוטים, מערכת החיסון המתוארת היטב, ונוכחותן של שיטות להערכת המורפולוגיה והתפקוד לאחר הניתוח הם טיעונים חשובים לשימוש במודל בעלי חיים גדול זה במחקר המוצג.

הליך כירורגי
למיטב ידיעתנו, אין טכניקות כירורגיות סטנדרטיות ומקובלות להשתלת זגוגית של תאי RPE על נשאים. אחד הנושאים המרכזיים של טיפול בתחליפי תאים הוא הטכניקה הכירורגית המאתגרת שיש בה סיכון לסיבוכים תוך ניתוחיים ואחרי ניתוח הקשורים להיפרדות רשתית, היפוטוניה, דימום אפיסקלרלי, כורואידי ו / או רשתית, ומערבולות תוך עיניות גבוהות, שעלולות להוביל לנזק לפיגומים. לאחר הניתוח, קיים סיכון של vitreoretinopathy שגשוג, אנדופתלמיטיס, hypotony, היפרדות רשתית, היווצרות קטרקט 4,10,13,14,15.

המחקרים הראשונים על גישות באמצעות נשאי תאים בוצעו בארנבים ממזרים צ'ינצ'ילה13,16,25. למרות שבעלי חיים אלה מייצגים מודל של בעלי חיים קטנים, התוצאות המתמקדות בהיבטים הטכניים של הניתוח היו מכריעות בפיתוח ההליכים במודלים של בעלי חיים גדולים ולכן מסוכמות להלן.

צינורית עירוי 23 G בהתאמה אישית שימשה בתחילה עם שתי יציאות צדדיות על מנת להפנות מחדש את זרם הסילון, מה שעזר לפתור את קריסת ה- bleb וכתוצאה מכך ניתוק רשתית13. במחקר הנוכחי לא שמנו לב לקריסה כזו של הבלב. הסיבה האפשרית לכך יכולה להיות הגודל הגדול יותר של גלגל העין והביצועים של ויטרקטומיית הליבה עם זגוגית חסכנית בשוליים באתר עירוי הצינורית, מה שיכול להפחית את הכוח של זרם הסילון המכוון.

קשיים במהלך הוצאת המוביל של התא מהמכשיר היו מכשול תוך ניתוחי נוסף במודלים של בעלי חיים קטנים, אשר סווגו כ"לכודים עם המכשיר". בנוסף, החוקרים הציעו כי שאריות הזגוגית על פני הרשתית עלולות לגרום ל"קפיצה" לאחור של הנשא אל מחוץ לפתח הרטינוטומיה לאחר ההשתלה. בעיה זו ניתנת לפתרון באמצעות ויטרקטומיה בסיוע אנזים, המאפשרת פליטה חלקה ורציפה של נשא התא לחלל התת רשתית. ברוב המקרים, המחברים מיקמו מחדש את הנשא כדי להשיג מיקום מרוחק יותר של השתל הרחק מרטינוטומיה. גם בסדרת המקרים שלנו חווינו מצב שבו המוביל הסלולרי נשאר מחובר לקצה המזרק. עם זאת, זה נוהל על ידי מניפולציה איטית ועדינה של צינור האור ואת קצה המזרק. לא ראינו שום שאריות זגוגית באתר של רטינוטומיה באף אחד מהמקרים שלנו. ניתן להציע את השימוש ב- PPV בסיוע ת"א בניתוחים כשיטה להפחתת הסיכון לזגוגית מחוברת שיורית. ייתכן שיהיה צורך בכתמים מרובים עם TA כדי להסיר את הזגוגית שמעל לחלוטין.

במחקר אחר, דווחו תוצאות של השתלה תת-רשתית של תאי גזע RPE אנושיים שגדלו כחד-שכבה תאית מקוטבת על קרום פוליאסטר24. במהלך הניסויים, אותה טכניקה כירורגית שתוארה קודם לכן שימשה13, אך יושמה גישת PPV בעלת שתי יציאות. לבסוף, פרוטוקול שלב אחר שלב להשתלה תת-רשתית של ניתוח נשאות תאים בארנבים פורסם לאחר מכן25. מחקר זה מציג תיאור מפורט מאוד וקל לחזור על עצמו של ההליך הכירורגי, כולל טיפול לפני הניתוח ולאחר הניתוח, המבוססים גם על ניסיון קודם.

במהלך השימוש במודלים של בעלי חיים גדולים במחקרים הבאים, לא רק שאלות טכניות טופלו אלא גם שאלות לגבי התגובה החיסונית לתאים המושתלים, כמו גם בעיות הקשורות לגודל נשא התא. מחקר שהשתמש בקופי צינומולגוס (Macaca fascicularis) תיאר את תוצאות ההשתלה התת-רשתית של מונושכבות RPE15 שמקורן בתאי גזע אנושיים. כל בעלי החיים עברו דיכוי חיסוני סיסטמי, שכלל סירולימוס (מינון העמסה של 2 מ"ג, מינון יומי של 1 מ"ג) וטטרציקלין (7.5 מ"ג/ק"ג-BW) החל מ-7 ימים לפני הניתוח ונמשך 3 חודשים לאחר הניתוח. ההליך הכירורגי בוצע על פי פרוטוקולים שתוארו קודם לכן24,25. המחברים השתמשו בגישת PPV של 25 G עם שלוש יציאות עם תאורת אנדו-תאורה של נברשת. חשוב לציין, PVD בסיוע TA שימש כדי לשלול הידבקות שיורית של הזגוגית על הרשתית האחורית. כתוספת להליך המתואר במקור, המחברים הסירו את שכבת RPE המארחת באזור ההשתלה העתידית באמצעות מכשיר לולאה ניתנת להרחבה בהתאמה אישית של 20 G.

במחקר המיני-חזיר שלנו השתמשנו גם בדיכוי חיסוני מערכתי. עם זאת, סוג הדיכוי החיסוני היה שונה מזה שתואר לעיל. נתנו זריקה תת-עורית של מיקרוספרות פולימריות פולטות טקרולימוס כמחסן במינון של 0.25 מ"ג/ק"ג BW כדי לעכב דחיית שתלי תאים ותגובות דלקתיות. לא הסרנו את שכבת תאי RPE המאכסן במהלך הניתוח, מכיוון שמטרתנו העיקרית הייתה לנתח את בטיחות ההליך ואת הכדאיות של התאים המושתלים, אך לא את שילובם ברשתית המארחת.

בעבר, הבטיחות וההיתכנות של השתלה תת-רשתית של שכבה חד-שכבתית של RPE שמקורו ב-hESC על קרום תת-מיקרוני פרילן-C תת-מיקרוני מתקפל שאינו מתכלה (6.25 מ"מ x 3.5 מ"מ, 0.4 מיקרומטר עובי) הוערך ב-14 נקבות מיני-חזירות יוקטן10. לאחר הגידול, התאים נזרעו על קרום נתמך רשת. דיכוי חיסוני בוצע באמצעות מתן סיסטמי של tacrolimus (לא משטר ומינון מצוין) וזריקות intravitreal של 0.7 מ"ג של שתל dexamethasone בסוף הניתוח. PPV בוצע בגישה של 20 G. המחברים השתמשו בהזרקה תוך ויטריאלית של אצטוניד triamcinolone להדמיה טובה יותר של גוף הזגוגית. גודל הסקלוטומיה הגדולה היה 2 מ"מ עד 3 מ"מ. לאחר ההזרקה התת-רשתית, הרשתית שוטחה בהזרקה זמנית של נוזל פרפלואורופחמן. לאחר חילופי נוזל-אוויר, טמפונדה שמן סיליקון (1,000/5,000 cSt) בוצע. הטיפול לאחר הניתוח כלל מריחה עינית של משחת דקסמתזון/נאומיצין/פולימיקסין B שבוע לאחר הניתוח. המחברים דיווחו על שיעור הצלחה של 91% (כלומר, השתלה תת-רשתית יעילה ונתוני הדמיה מספקים לאחר הניתוח). במחקר שלנו, הזרקה תוך ויטריאלית של גבישי TA שימשה תוך ניתוחית ובעיקר כדי לדמיין את גוף הזגוגית. עם זאת, הפעולה החיסונית המקומית של תרופה זו נותרה לא ברורה. נשאי התאים הננו-סיביים ששימשו במחקר שלנו היו בגודל 5.2 מ"מ x 2.1 מ"מ ועובי 3.7 מיקרומטר, עם גודל נקבוביות של 0.4 מיקרומטר. במהלך הניתוח ביצענו פקס ישיר במקום הזרקת נוזל פרפלואורופחמן. שיעור ההצלחה הניתוחית שלנו (93.1%) היה עקבי ומעט טוב יותר מזה של Koss et al.10.

השתלת תת-רשתית של נשאי תאים מתכלים לחלוטין (פיגומים) להשתלה תת-רשתית נחקרה לראשונה בשנת 2019 בחזירי יורקשייר14. המחקר התמקד בעיקר במאפיינים המתכלים של שתלי פיברין הידרוג'ל. החוקרים ציינו כי הדיכוי החיסוני האגרסיבי המשמש את חזירי הבית יכול לעכב תגובה דלקתית מקומית שעלולה להיגרם במהלך פירוק ביולוגי של שתלי פיברין הידרוג'ל. עם זאת, הם לא ציינו את הטיפול החיסוני המשמש את החזירים. במהלך PPV הם ביצעו סקלרוטומיה באורך 3.6 מ"מ להחדרת מכשיר ההשתלה התת רשתית במקביל ובערך 3.5 מ"מ אחורי ללימבוס. בנוסף, הם השתמשו במערכת הזרקה פנאומטית שמטרתה להפחית את חוסר היציבות של מיקום היד הנגרם על ידי מניפולציה באצבע. במקרה שלנו, כל הטרשת הייתה במרחק של 2.5 מ"מ עד 3.0 מ"מ מהלימבוס. אורך הסקלוטומיה הגדולה להחדרת המזרק היה 3 מ"מ. מזרק ההשתלה ששימש במחקר שלנו הופעל ביד. נראה כי צריבה יסודית של pars plana של הגוף הריסי וחתך מספיק בתוך הסקלרוטומיה הגדולה חיוניים למניעת סיבוכים תוך ניתוחיים כגון היפרדות רשתית היקפית יאטרוגנית, דימום ואובדן השתל.

לסיכום, אנו מתארים את השימוש במודל Liběchov minipig להשתלת תאי RPE על נשאים מתכלים כאפשרות טיפול במחלות רשתית תורשתיות ונרכשות. קווי דמיון באנטומיה ובפיזיולוגיה של העין, כמו גם לגבי המערכת החיסונית, מאפשרים לנו לפתח ולשפר את הטכניקות הכירורגיות ואת המכשור להשתלה תת רשתית של תאים, אשר ניתן להעביר בקלות לטיפול בהפרעות עיניים אנושיות. חשוב לוודא כי ניתוחים במיני-חזירים מבוצעים באמצעות אותו מכשור (כולל כלים להעברת השתלות) כאשר הם משמשים בניתוחים אנושיים, ובכך להקל על יישום הניסיון והידע שנצברו לבני אדם. מודלים חלופיים של בעלי חיים גדולים עם נוכחות של אזור מקולרי, כגון פרימטים שאינם אנושיים, יכולים להיות שימושיים למעקב וניתוח של השינויים האנטומיים והתפקודיים לאחר השתלה תת-רשתית באזור הרשתית המרכזית. התיאור המפורט של הליכי הטיפול לפני הניתוח, הניתוח ולאחר הניתוח יהיה שימושי למחקרים עתידיים על ידי הגברת ייצור נתונים יעיל וסטנדרטי.

Acknowledgements

הפרויקט נתמך על ידי קרן המדע הצ'כית (פרויקט מספר 18-04393S) והסוכנות הנורבגית למענקים וטכנולוגיה של הרפובליקה הצ'כית (תוכנית KAPPA, מספר פרויקט TO01000107).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Technical equipment
Wato EX-65 with a Mindray iMEC10Mindray, Shenzhen, ChinaWato Ex-65anesthesia machine
R-Evolution CROptikon, Rome, ItalyR-Evolution CRphacoemulsifier/vitrectome
Green laser Merilas 532αMeridian, Thun, SwitzerlandMerilas 532αophthalmic green laser
Microscope Hi-R NEO 900AHaag-Streit Surgical, Wedel, Germany)Hi-R NEO 900Aophthalmic surgery microscope
Camera Sony PMW-10MDSony, Tokyo, JapanPMW-10MDfull HD medical 2-piece 
Non-contact vitreoretinal surgical system MERLIN BIOMVolk, Mentor, OH, USAMERLIN BIOMBIOM
Steam sterilizerTuttnauer Europe B.V., Breda, NL3870 HSGsterilizer
iCam100Optovue, Fremont, CA, USAiCAM100funduscamera
iVue OCT100-2Optovue, Fremont, CA, USAiVue OCT100-2OCT
Microsurgical instruments and devices
Cook Eye SpeculumKatena, New Jersey, USK1-540315mm blades
Ophthalmology surgical drapeHylyard, Alpharetta, Georgie, USA79304132 x 142cm
Disposable Two step vitrectomy system. (23 gauge/ 0.6 mm)DORC, Zuidland, Netherlands1272.ED06
Infusion line for 23G / 0.6 mm infusion cannulaDORC, Zuidland, Netherlands1279.P
knife 2.75mm, IQ Geometry Tm Slit Knife Angled, Bevel UpSurgical Specialties Corporation, Reading, USA72-2761G
Extendible 41G subretinal injection needle. (23 gauge / 0.6 mm)DORC, Zuidland, Netherlands1270.EXT
Omnifix 3ml Luer Lock Solo siringeBBraun, Melsungen, Germany4617022V3ml
1ml soft-inject TuberculinHenke Sass Wolf, Tuttlingen, Germany5010.200V01ml
8-0 Coated VicrylEthicon, Puerto Rico, USAJ409G
Purified Silicone Oil (in syringe) 10 ml(FCI, Paris, France)S5.71701000cSt
Pinnacle 360 Morris Vertical Scissors 23GaSynergetics, O'Fallon, USA10.24.23PIN23Ga
Revolution DSP 23Ga ILM forcepsAlcon, Geneva, Switzerland706.44Griesharber revolution
23ga Straight Laser Probe Synergetics, O’Fallon, USA55.21.23
FCI Protect 2.0%FCI Ophthalmics, Paris, FranceS5.9100viscoelastic
DK Westcott style Stitch Scissors, CurveDuckworth & Kent, Hertfordshire, England1-501Curve
Pierse Notched Forceps, 0,3mm StraighDuckworth & Kent, Hertfordshire, England2-100-1E0,3mm straigh
DK Harms-Tubingen Straight Tying ForcepsDuckworth & Kent, Hertfordshire, England2-504E6mm
DK Needle Holder, StraighDuckworth & Kent, Hertfordshire, England3-2019mm straigh
Medications and solutions
Unitropic 1% gtt. UNIMED PHARMA spol. s r.o., Bratislava, Slovak republictropicamidum 10 mg/mleye drops
DiprophosMerck Sharp & Dohme B.V., Haarlem, Netherlandsbetamethasonum 7 mg/ml1ml
Alcon BSS Irrigation SolutionAlcon, Geneva, Switzerlandbalance salt solution (BSS)500ml
BetaisodonaMundipharma, Cambridge, United Kingdompovidon-Iodine 1g/10ml30ml
Depo-medrol 120mgPfizer, New Yourk, USAmethylprednisolon5ml/200mg
ShotapenVirbac Carros Cedex, Francebenzylpenicillin, dihydrostreptomycin250ml
Flunixin a.u.v.Norbrook, Newry, Northern Irelandflunixinum 50,0 mg250ml
Tramal 100MG/2MLStada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschlandtramadol2ml
Zoletil 100Virbac Carros Cedex, Francetiletamine, zolazepam100mg
Narkeran 10Vetoquinol, Magny-Vernois, Franceketamin2ml
Rometar 20mg/mlSpofa pharmaceutica, Prague, Czech republicxylazinum20mg
Braunol 75mg/gB.Braun medical, Prague, Czech republicpovidone iodine75mg/g
Propofol 1% MCT/LCTFresenius Kabi, Bad Homburg, Deutschlandpropofol10mg/1ml
Isoflurane 100% Inhalation vapour, liquidPiramal Critical Care Limited, West Drayton, United Kingdomisoflurane100%
Benoxi gtt.  4mg/1mlUnimed pharma, Bratislava, Slovakiaoxybuprakaine10ml
Neosynephrin POS 10% gtt. Ursapharm , Saarbrücken, Deutschlandfenylefrin chloride10ml
Ophthalmo-framykoin 1X5GMZentiva a.s.,  Prague, Czech republicbacitracin zinc/hydrocortisone acetate/hydrocortisoneacetate/neomycin sulfate5mg
Floxal ung.Dr. Gerhard Mann Chem.-Pharm. Fabrik, Berlin, Germanyofloxacin0.30%
Eficur inj. Hipra, Amer, Spainceftiofurum hydrochloridum 50mg / 1ml
DraxxinZoetis Inc., New Jersey, USAtulathromycinum100mg / 1ml
TramalStada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschlandtramadoli hydrochloridum100mg / 2ml
XylapanVetoquinol, Magny-Vernois, Francexylazinum0.4 mg/kg
Proparacaine hydrochlorid ophthalmic solution 0,5%Bausch&Lomb Incorporated Tampa, FL, USAProparacaine hydrochlorid0.50%
Prograf Astellas Pharma, Deerfield, Illinois, USATacrolimus powder1mg
Cell carrier, cultivated cells cultures, and implantation injector
Falcon Cell Culture InsertsCorning Inc., Kenneburg, ME, USA353103
TrypLE Express Enzyme (1X)Thermo Fisher Scientific, MA, USA12604021
DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific, MA, USA11320033
Biolaminin 521 LN (LN521)BioLamina, Sundbyberg, SwedenLN521-02
GlutaMAX SupplementThermo Fisher Scientific, MA, USA35050061
2-MercaptoethanolThermo Fisher Scientific, MA, USAJ66742.0B
Penicillin-StreptomycinSigma-Aldrich, San Luis, Mi, USAP4333
CRALBPNovus Biologicals, Abingdon, UKNB100-74392
Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific, Germany 21202

References

  1. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. British Journal of Ophthalmology. 96 (5), 614-618 (2011).
  2. Bressler, N. M., Bressler, S. B., Fine, S. L. Age-related macular degeneration. Survey of Ophthalmology. 32 (6), 375-413 (1988).
  3. Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Transplantation of the RPE in AMD. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (5), 516-554 (2007).
  4. Mano, F., et al. Methodological approach to improve surgical outcomes of a pig subretinal implantation model. Translational Vision Science & Technology. 11 (4), 24 (2022).
  5. Ramsden, C. M., et al. Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future. Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).
  6. Carr, A. -. J. F., et al. Development of human embryonic stem cell therapies for age-related macular degeneration. Trends in Neurosciences. 36 (7), 385-395 (2013).
  7. Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (2), 467-476 (1999).
  8. Popelka, S., et al. A frame-supported ultrathin electrospun polymer membrane for transplantation of retinal pigment epithelial cells. Biomedical Materials. 10 (4), 045022 (2015).
  9. Kozak, I., et al. Safety and feasibility of new nanofiber subretinal delivery system with injector for RPE cell transplantation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (9), 5670 (2018).
  10. Koss, M. J., et al. Subretinal implantation of a monolayer of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium: a feasibility and safety study in Yucatan minipigs. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur Klinische und Experimentelle Ophthalmologie. 254 (8), 1553-1565 (2016).
  11. Ghosh, F., Wong, F., Johansson, K., Bruun, A., Petters, R. M. Transplantation of full-thickness retina in the rhodopsin transgenic pig. Retina. 24 (1), 98-109 (2004).
  12. Christiansen, A. T., et al. Subretinal implantation of electrospun, short nanowire, and smooth poly(epsilon-caprolactone) scaffolds to the subretinal space of porcine eyes. Stem Cells International. 2012, 454295 (2012).
  13. Stanzel, B. V., et al. Subretinal delivery of ultrathin rigid-elastic cell carriers using a metallic shooter instrument and biodegradable hydrogel encapsulation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 490-500 (2012).
  14. Gandhi, J. K., et al. Fibrin hydrogels are safe, degradable scaffolds for sub-retinal implantation. PloS One. 15 (1), 0227641 (2020).
  15. Liu, Z., et al. Surgical transplantation of human RPE stem cell-derived RPE monolayers into non-human primates with immunosuppression. Stem Cell Reports. 16 (2), 237-251 (2021).
  16. Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
  17. Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: Follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
  18. Kashani, A. H., et al. Surgical method for implantation of a biosynthetic retinal pigment epithelium monolayer for geographic atrophy: Experience from a phase 1/2a study. Ophthalmology Retina. 4 (3), 264-273 (2020).
  19. Kashani, A. H., et al. Subretinal implantation of a human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer in a porcine model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1185, 569-574 (2019).
  20. Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), 4097 (2018).
  21. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
  22. Diniz, B., et al. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: Improved survival when implanted as a monolayer. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (7), 5087-5096 (2013).
  23. Sharma, R., et al. Clinical-grade stem cell-derived retinal pigment epithelium patch rescues retinal degeneration in rodents and pigs. Science Translational Medicine. 11 (475), 7624 (2019).
  24. Stanzel, B., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
  25. Al-Nawaiseh, S., et al. A step by step protocol for subretinal surgery in rabbits. Journal of Visualized Experiments. (115), e53927 (2016).
  26. Stanzel, B., et al. Surgical approaches for cell therapeutics delivery to the retinal pigment epithelium and retina. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1186, 141-170 (2019).
  27. Yaji, N., Yamato, M., Yang, J., Okano, T., Hori, S. Transplantation of tissue-engineered retinal pigment epithelial cell sheets in a rabbit model. Biomaterials. 30 (5), 797-803 (2009).
  28. Hruban, V., et al. Inheritance of malignant melanoma in the MeLiM strain of miniature pigs. Veterinarni Medicina. 49 (12), 453-459 (2004).
  29. Vodicka, P., et al. The miniature pig as an animal model in biomedical research. Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 161-171 (2005).
  30. Vízina, M., Wier, A. B., Collins, M. Comparative Ocular Anatomy in Commonly Used Laboratory Animals. Ocular Toxicology in Laboratory Animals. , 9-12 (2013).
  31. Chandler, M. J., Smith, P. J., Samuelson, D. A., MacKay, E. O. Photoreceptor density of the domestic pig retina. Veterinary Ophthalmology. 2 (3), 179-184 (1999).
  32. Wang, Q. X., et al. Biodegradable microsphere-loaded tacrolimus enhanced the effect on mice islet allograft and reduced the adverse effect on insulin secretion. American Journal of Transplantation. 4 (5), 721-727 (2004).
  33. Sevc, J., et al. Effective long-term immunosuppression in rats by subcutaneously implanted sustained-release tacrolimus pellet: Effect on spinally grafted human neural precursor survival. Experimental Neurology. 248, 85-99 (2013).
  34. Juhásová, J., et al. Osteogenic differentiation of miniature pig mesenchymal stem cells in 2D and 3D environment. Physiological Research. 60 (3), 559-571 (2011).
  35. Planka, L., et al. Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs. Biomedical Papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czech Republic. 156 (2), 128-134 (2012).
  36. Soerensen, D. D., Pedersen, L. J. Infrared skin temperature measurements for monitoring health in pigs: a review. Acta Veterinaria Scandinavica. 57 (1), 5 (2015).
  37. Eichhorn, S. J., Sampson, W. W. Statistical geometry of pores and statistics of porous nanofibrous assemblies. Journal of the Royal Society Interface. 2 (4), 309-318 (2005).
  38. Szatmári-Tóth, M., et al. Clearance of autophagy-associated dying retinal pigment epithelial cells - a possible source for inflammation in age-related macular degeneration. Cell Death & Disease. 7 (9), 2367 (2016).
  39. Lukovic, D., et al. Human iPSC derived disease model of MERTK-associated retinitis pigmentosa. Scientific Reports. 5, 12910 (2015).
  40. Artero Castro, A., et al. Generation of gene-corrected human induced pluripotent stem cell lines derived from retinitis pigmentosa patient with Ser331Cysfs*5 mutation in MERTK. Stem Cell Research. 34, 101341 (2019).
  41. Artero Castro, A., León, M., Del Buey Furió, V., Erceg, S., Lukovic, D. Generation of a human iPSC line by mRNA reprogramming. Stem Cell Research. 28, 157-160 (2018).
  42. Artero-Castro, A., et al. correction recovers phagocytosis in retinal pigment epithelium derived from retinitis pigmentosa-human-induced pluripotent stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2092 (2021).
  43. Müller, B., Wagner, F., Lorenz, B., Stieger, K. Organotypic cultures of adult mouse retina: Morphologic changes and gene expression. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (4), 1930-1940 (2017).
  44. Sheridan, C. M., et al. Replacement of the RPE monolayer. Eye. 23 (10), 1910-1915 (2009).
  45. Radtke, N. D., et al. Vision improvement in retinal degeneration patients by implantation of retina together with retinal pigment epithelium. American Journal of Ophthalmology. 146 (2), 172-182 (2008).
  46. Maaijwee, K. J. M., et al. Histological evidence for revascularisation of an autologous retinal pigment epithelium--choroid graft in the pig. The British Journal of Ophthalmology. 91 (4), 546-550 (2007).
  47. Ghosh, F., Engelsberg, K., English, R. V., Petters, R. M. Long-term neuroretinal full-thickness transplants in a large animal model of severe retinitis pigmentosa. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur Klinische und Experimentelle Ophthalmologie. 245 (6), 835-846 (2007).
  48. Radtke, N. D., Seiler, M. J., Aramant, R. B., Petry, H. M., Pidwell, D. J. Transplantation of intact sheets of fetal neural retina with its retinal pigment epithelium in retinitis pigmentosa patients. American Journal of Ophthalmology. 133 (4), 544-550 (2002).
  49. Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 137-159 (2015).
  50. Schramke, S., et al. The Libechov minipig as a large animal model for preclinical research in Huntington's disease - Thoughts and perspectives. Czech and Slovak Neurology and Neurosurgery. 78/111, 55-60 (2015).
  51. Tohyama, S., Kobayashi, E. Age-appropriateness of porcine models used for cell transplantation. Cell Transplantation. 28 (2), 224-228 (2019).
  52. Dall, A. M., et al. Quantitative [18F] fluorodopa/PET and histology of fetal mesencephalic dopaminergic grafts to the striatum of MPTP-poisoned minipigs. Cell Transplantation. 11 (8), 733-746 (2002).
  53. Shrader, S. M., Greentree, W. F. Göttingen minipigs in ocular research. Toxicologic Pathology. 46 (4), 403-407 (2018).
  54. Duarri, A., et al. Transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium in a swine model of geographic atrophy. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10497 (2021).

Explore More Articles

189RPEpars plana vitrectomyPPVin vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved