Subretinal implantasjon av RPE på en bærer i minigriser: retningslinjer for preoperative preparater, kirurgiske teknikker og postoperativ behandling

Summary

Den subretinale implantasjonen av retinalpigmentert epitel (RPE) er en av de mest lovende tilnærmingene for behandling av degenerative retinale sykdommer. Imidlertid er ytelsen til prekliniske studier på store øyedyrmodeller fortsatt utfordrende. Denne rapporten presenterer retningslinjer for subretinal transplantasjon av RPE på en cellebærer i minigriser.

Abstract

Degenerative forstyrrelser i netthinnen (inkludert aldersrelatert makuladegenerasjon), som primært stammer fra eller innenfor retinalpigmentert epitel (RPE), fører til en progressiv disorganisering av retinalanatomien og forverring av visuell funksjon. Substitusjonen av skadede RPE-celler (RPE) med in vitro-dyrkede RPE-celler ved bruk av en subretinal cellebærer har vist potensial for å gjenopprette den anatomiske strukturen til de ytre retinale lagene og blir derfor studert videre. Her presenterer vi prinsippene for en kirurgisk teknikk som muliggjør effektiv subretinal transplantasjon av en cellebærer med dyrkede RPEer til minigriser. Operasjonene ble utført under generell anestesi og inkluderte en standard linsesparende tre-port pars plana vitrektomi (PPV), subretinal påføring av en balansert saltløsning (BSS), en 2,7 mm retinotomi, implantasjon av en nanofibrøs cellebærer i subretinalrommet gjennom en ytterligere 3,0 mm sklerotomi, væske-luftutveksling (FAX), silikonoljetamponade og lukking av alle sklerotomiene. Denne kirurgiske tilnærmingen ble brukt i 29 operasjoner (18 dyr) de siste 8 årene med en suksessrate på 93,1%. Anatomisk verifikasjon av operasjonsplasseringen ble utført med in vivo fundusavbildning (fundusfotografering og optisk koherenstomografi). De anbefalte kirurgiske trinnene for subretinal implantasjon av RPE på en bærer i minigrisøyne kan brukes i fremtidige prekliniske studier ved bruk av store øyedyrmodeller.

Introduction

Aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) regnes som hovedårsaken til sentralt synstap i utviklede land og er en av mange forhold relatert til retinalpigmentert epitel (RPE) dysfunksjon ^1,2. RPE finnes på den basalt lokaliserte Bruchs membran (BM) og gir nødvendig vedlikehold for fotoreceptorene. Den progressive degenerasjonen av RPE-laget er et kjennetegn ved den tidlige atrofiske formen for AMD, og den følger også med utviklingen av den sene eksudative formen for AMD også. Til tross for mange fremskritt innen retinal sykdomsterapi, er utviklingen av en effektiv behandlingsmodalitet fortsatt utfordrende³. En av de lovende metodene er RPE-erstatning ved hjelp av et in vitro-dyrket RPE-lag. Denne behandlingen er assosiert med fremgang i stamcelleforskning ved bruk av human embryonal stamcelleavledet RPE (hESC-RPE) og indusert pluripotent stamcelleavledet RPE (iPSC-RPE) 3,4,5,6,7. I de senere år har mange forskningsgrupper fokusert på å utvikle ulike tilnærminger for RPE-erstatning med det opprinnelig aksepterte proof-of-concept 8,9,10,11,12,13,14,15. RPE-cellene (RPE) leveres vanligvis inn i det subretinale rommet i form av en cellesuspensjon, et selvbærende celleark eller et cellemonolag støttet av en kunstig bærer 3,16,17,18,19,20,21. Injeksjon av en cellesuspensjon er den enkleste metoden, men den kompromitterte tilstanden til BM kan ofte forhindre vedlegg av de transplanterte cellene. Dette kan resultere i feil apikobasal orientering av RPEene og manglende dannelse av et monolag^22,23. Den største fordelen med de to andre metodene (dvs. et selvbærende celleark og et cellemonolag støttet av et kunstig substrat) er at cellene allerede er i en differensiert monolagstilstand når de implanteres direkte i subretinalrommet²⁴.

Mange kirurgiske teknikker som beskriver levering av cellebærere i subretinalrommet har blitt publisert de siste årene 8,9,10,11,12,13,14,15. Disse studiene beskrev bruken av store øye dyremodeller, typer cellulære bærere, bruk av transplanterte cellulære kulturer, implantasjonsinstrumenter, samt kirurgiske teknikker, og forfatterne fokuserte hovedsakelig på resultatene av subretinal implantasjon. I 2015 rapporterte Popelka et al. bruken av en rammestøttet ultratynn elektrospunnet polymermembran for transplantasjon av RPE i svinekadaver øyne⁸. Den kirurgiske teknikken beskrevet her med subretinal implantasjon av cellebæreren tillot relativt presis håndtering av bæreren og enkel posisjonering av stillaset i subretinalrommet. Kozak et al. vurderte muligheten for leveringsteknikken til en transportør med en omtrentlig størrelse på 2 mm x 5 mm i svineøyne⁹. Den unike utformingen av cellebæreren tillot riktig plassering, og forhindret det cellulære monolaget i å brette seg og rynke⁶. Al-Nawaiseh et al. presenterte først detaljerte trinnvise retningslinjer for subretinal stillasimplantasjon hos kaniner²⁵. Stanzel et al. publiserte deretter en lignende protokoll i 2019 for transplantasjon hos smågnagere, kaniner, griser og ikke-menneskelige primater²⁶. Som tidligere publisert resulterte transplantasjon av et differensiert og polarisert RPE-monosjikt på en fast bærer i bedret overlevelse og bedre integrering av transplantatet sammenlignet med andre forløsningsteknikker (tilleggsfil 1)²⁷.

Formålet med alle prekliniske dyrestudier utført in vivo er å avdekke de ulike aspektene ved kirurgisk transvitreal subretinal implantasjon av en cellebærer med fokus på prosedyren sikkerhet, overlevelse av de transplanterte cellene, vevsrespons på subretinale manøvrer og kortsiktige og langsiktige postoperative utfall. Bruken av svineøyne som en storøyet dyremodell har blitt rapportert å være relevant med tanke på omfanget av dataene som er innhentet, noe som kan være nyttig og potensielt anvendelig for mennesker^10,11,14. Vår studie rapporterer den kirurgiske teknikken som brukes til in vivo subretinal implantasjon av en cellebærer i en storøyet dyremodell. Vi presenterer en detaljert beskrivelse av preoperative preparater, kirurgisk teknikk for subretinal cellebærerimplantasjon og postoperativ pleie av minigrisøynene basert på vår erfaring de siste 8 årene. Vi beskriver de grunnleggende kirurgiske prinsippene som kan brukes til in vivo eksperimentelle studier som involverer implantasjon av ulike typer celler og cellebærere.

Stor dyremodell
Den eksperimentelle flokken av Liběchov minipigs ble grunnlagt ved å importere fem dyr fra Hormel-stammen fra USA i 1967. Disse dyrene ble krysset for blodgruppestudier av svin med flere andre raser eller stammer: Landrace, Large White, Cornwall, vietnamesiske griser og miniatyrgriser av Göttingen opprinnelse^28,29. Ved 5 måneders alder og ca. 20 kg kroppsvekt blir minigrisene kjønnsmodne. Overlevelsen av foreldrenes minigrisraser (Hormel og Göttingen) er rapportert å være 12-20 år. Den subretinale implantasjonen av cellebæreren retter seg mot den sentrale delen av netthinnen. Netthinnen av minipigs mangler en makula og fovea. Imidlertid har den regioner med høyt konsentrerte kjeglefotoreseptorer kalt området centralis og visuelle striper^30,31. Disse områdene er ansvarlige for den høyeste synsstyrken.

Operasjonene ble utført av fire erfarne vitreoretinale kirurger med hjelp av en erfaren kirurgisk anleggsassistent (TA). Før in vivo-eksperimentene ble kirurgene utdannet og oppnådd spesiell kunnskap om minipig øyeanatomi, for eksempel med hensyn til det lavere forholdet mellom linse og glassvolum, den kortere aksiale lengden (15-19 mm), fraværet av Bowmans membran i hornhinnen, det mindre glassvolumet (2, 8-3, 2 ml), fraværet av makula og fovea, fraværet av ringrommet til Zinn, og den optiske skivediameteren (vertikal/horisontal: 1,5 mm/2,1 mm). I alle tilfeller ble operasjonen utført under generell anestesi i et spesielt organisert operasjonsrom med implementering av standard aseptiske og antiseptiske tiltak.

Protocol

Denne studien følger prinsippene i retningslinjene i Helsinkideklarasjonen og etiske prinsipper for medisinsk forskning som involverer mennesker. Alle forsøkene ble utført i henhold til Retningslinjer for stell og bruk av forsøksdyr og i henhold til Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) for bruk av dyr i oftalmisk og visuell forskning. Studieprotokollen ble godkjent av Resort Professional Commission of CAS for godkjenning av prosjekter av eksperimenter på dyr ved Institutt for dyrefysiologi og genetikk ved det tsjekkiske vitenskapsakademiet (Liběchov, Tsjekkia) (godkjent protokoll nr. 60/2016 og nr. 64/2019).

1. Betraktninger under subretinal transplantasjon av celler på en bærer i minigriser

1. Valg av dyr
   1. Skaff og bruk Liběchov minigriser som er 12-36 måneder gamle, begge kjønn, og rundt 40-80 kg kroppsvekt (BW).
   2. Hold minigrisene innendørs i et luftkondisjonert dyrehus med temperaturer mellom 18-22 ° C, eksponering for en kunstig 13 t / 11 t lys / mørk syklus, standardiserte individuelle penner, fri tilgang til vann og to ganger daglig fôring.
2. Forberedelse før operasjonen
   1. Sjekk for øyets kirurgiske orientering og tegne fundusordningene. For å gjøre dette, del skjematisk netthinnen til minigrisene på fundustegningen ved hjelp av en penn med en vertikal linje inn i temporale (fra optisk skive mot øret), nasal (fra optisk plate mot grisens snute) og sentrale (mellom de store retinalkarene på nesesiden) regioner (figur 1A, B).
   2. Velg bare friske dyr uten atferdsmessig og nevrologisk patologi og med normal kvalitet på hud, kroppsåpninger, avføring og matforbruk. Få en dyktig veterinær til å utføre den kliniske observasjonen og velge ut dyrene.
   3. Injiser intramuskulært 3 mg/kg kroppsvekt ceftiofurhydroklorid (1 ml/kg) på operasjonsdagen.
3. Preoperativ immunsuppresjon
   1. Forbered takrolimus-eluerende polymermikrosfærer som beskrevet i Wang et al. og Sevc et al. ^32,33 med modifikasjon.
   2. Sørg for at konsentrasjonen av takrolimus i polymermikrosfærene er 51,3 mg/g som bestemt ved HPLC (materialfortegnelse).
   3. Utfør en subkutan injeksjon av takrolimusbelastede polymermikrosfærer i en dose på 0,25 mg/kg kroppsvekt 6 dager før øyekirurgien for å hindre avstøtning av celletransplantat. Dette gjøres for å sikre overlevelse av de humane RPE-donorcellene under xenogen transplantasjon i minigrisøynene.
   4. Injiser dyrene intramuskulært på operasjonsdagen med 80 mg depo-medrol og benzylpenicillin på 1 ml / 10 kg i henhold til kroppsvekten.
4. Anestesi
   1. Indusere generell anestesi med intramuskulær injeksjon av en blanding av tiletamin (2 mg / kg), zolazepam (2 mg / kg), ketamin (2 mg / kg) og xylazin (0,4 mg / kg) -TKX^34,35 før operasjonen. Kontroller dybden av anestesi ved en tilstand av bevisstløshet og ved å kontrollere pedalrefleksen (en klype av den interdigitale huden på bakbenet), hornhinnerefleksen (en liten berøring av hornhinnen), pupillrefleksen (reaksjon på lyset) og palpebralrefleksen (en berøring på øyelokket). Sørg for at dyret ikke blinker. Bekreft regelmessig hjerte og respirasjonsfrekvens.
   2. Etter innledning av anestesi, transporter det bedøvede dyret til operasjonssalen på en heisvogn (figur 2A).
   3. Plasser dyret på operasjonsbordet på venstre side for å muliggjøre kirurgi på høyre øye (figur 2B).
   4. Utfør justeringen av dyrets hode ved hjelp av isoporputer for å oppnå den mest passende posisjonen til den sentrale netthinnen for implantasjon (dvs. horisontal og parallelt med gulvet) (figur 2C).
   5. Plasser øyedråper med 0,5% proparakainhydroklorid oftalmisk oppløsning i konjunktivalsekken tre ganger 1 min fra hverandre for å indusere lokalbedøvelse.
   6. Sett inn en venekanyle og intuber dyret med en endotrakealslange for inhalasjon vedlikehold av anestesi (1,5 % isofluran) ved hjelp av en anestesimaskin utstyrt med pasientmonitor (figur 2A, B).
   7. Administrer en intramuskulær injeksjon med 1 ml Eficur per 16 kg kroppsvekt og 20 mg Depo-Medrol 1 ca. 15 minutter før øyekirurgien begynner (materialfortegnelse).
   8. Oppretthold den fysiologiske kroppstemperaturen ved å dekke dyret med isotermisk folie og utfør operasjonen som beskrevet i avsnitt 3.
   9. Under operasjonen må du overvåke dyrets temperatur sammen med hjertefrekvensen og oksygenmetningen i blodet ved hjelp av en øreklemme og pasientmonitor. Unngå senking av kroppstemperaturen under 38 °C under prosedyrene, som regnes som en sikker grense³⁶. Oppretthold oksygenmetningen (>96%) og pulsfrekvensen (70-90 slag per minutt) under hele eksperimentet.
   10. Når operasjonen er fullført, slå av strømmen av isofluran og ekstuber dyret.
   11. Etter spontan pust og oppvåkning, overfør dyrene til pennene.
5. Oppsett av operasjonsstue
   1. Ordne operasjonssalen i henhold til operasjonens behov på øynene til storøyedyrmodellen (figur 3A, B). Juster høyden på kirurgens stoler, så vel som mikroskopets høyde, for å oppnå en komfortabel stilling for kirurgene med hensyn til posisjonen til grisens snute.

Figur 1: Skjematisk tegning av netthinnesonene hos minigriser. (A) Skjematisk tegning av netthinnesonene i forhold til minigrisens hode; den gule ellipsen skildrer det ønskede området med subretinal implantasjon, T refererer til det temporale retinalområdet, og N refererer til det nasale retinalområdet. (B) Eksempel på fundusordningen etter subretinal implantasjon av cellebæreren (gul) gjennom retinotomi (rød). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Transport og plassering av dyret . (A) Transport av det bedøvede dyret til operasjonssalen. (B) Plassering av dyret under intubasjon. (C) Justering av dyrets hode for optimal tilgang til den sentrale netthinnen under operasjonen (rød pil). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Standard operasjonsstueoppsett. (A) Skjematisk fremstilling av kirurgenes posisjon (S = kirurg, A = assistent) i forhold til operasjonsbordets plassering med minigrisen, operasjonsmikroskopet (OM), vitrektomimaskinen (VM), instrumentaltabellen (IT) og anestesiologimaskinen (AM). Det er to mulige posisjoner av vitrektomimaskinen (gul og grå). (B) Real-life setting i operasjonssalen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. Cellebærer, dyrkede cellekulturer og implantasjonsinjektor

1. Cellebærer
   1. Klipp den 30 μm brede ovale rammen med ytre dimensjoner på 1,7 mm x 4,8 mm, utstyrt med trekantede fremspring asymmetrisk plassert på rammen (figur 4A), fra en bi-aksialt orientert 36 μm tykk polyetylentereftalat (PET) folie ved hjelp av en femtosekund laser.
   2. Klargjør poly (L-laktid-co-DL-laktid) (LLA / DLLA 90/10, MW 868, 270 g / mol) polymeroppløsning i pyridin i en konsentrasjon på 11 vekt% med tilsetning av 2,2 μL maursyre per 1 g oppløsning.
   3. Forbered nanofibrøs membran med en innebygd støtteramme (figur 4B) ved elektrospinning av polymeroppløsningen i tre trinn⁸: (1) avsett det første laget av nanofibre på et silisiumsubstrat, (2) plasser rammen på laget, og (3) avsett det andre laget av nanofibre.
      MERK: Legg hvert lag i 7 minutter for å nå en total membrantykkelse på 3,7 μm. Bruk følgende parametere for å oppnå en membran sammensatt av 380 nm tykke fibre og med en gjennomsnittlig porestørrelse på 0,4 μm og en porøsitet på ca. 70%³⁷: en 20 G allstålnål, en spenning på 7,1 kV, et gap på 10 cm, en strømningshastighet på 250 μL/min og en temperatur på 25,0 °C ± 0,5 °C.
   4. Fjern forsiktig membranen med den innebygde rammen fra silisiumsubstratet og fest den til kroppen til en kommersiell 12-brønns cellekulturinnsats uten den opprinnelige membranen for å lette såing og vekst av celler.
   5. Behandle nanofibrøs membran før cellesåing i luftplasma i 30 s med en effekt på 70 W i en plasmarenser.
2. Cellekulturer som brukes til dyrking på cellebæreren
   MERK: Følgende cellebærere kan brukes: 1) nanofibrøse cellebærere uten celler; 2) nanofibrøse cellebærere med primære humane RPEs (hRPEs); 3) nanofibrøse cellebærere med humane iPSC-avledede RPE-celler.
   1. Dyrking av primære hRPEs
   2. Isoler primære hRPE-celler fra humane donorøyne i henhold til en tidligere rapportert teknikk³⁸.
   3. Få cellene ved enzymatisk behandling av netthinnen i 30 minutter. Deretter dyrker du de primære hRPE-cellene (passasje 0) i opptil 2 uker i DMEM / F12 supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS).
   4. Når cellekulturene når sammenløp, endre mediet til 1% FBS og kultur i ytterligere 30 dager.
   5. Frø de primære hRPEene på transbrønnplater og på en lamininbelagt nanofibrøs cellebærer med en tetthet på 2000 celler / mm². Etter ytterligere 30 dagers inkubasjon i 1% FBS, bruk cellebærerne med primære hRPEer for subretinal implantasjon i minigriser.
3. Humane iPSC-avledede RPE-er
   1. Bruk hiPSCs avledet fra MERTK assosiert retinitis pigmentosa pasientavledede fibroblaster 39 som er genkorrigert i to alleler ved bruk av CRISPR /^{Cas9-systemet} (RP1-FiPS4F1-GC2) ⁴⁰, samt hiPSCs avledet fra fibroblaster av et sunt individ (Ctrl2-FiPS5F2) ⁴¹ som brukes som en kontroll.
   2. Generere og deretter differensiere begge hiPSCs cellelinjer mot RPE-celler (hiPSC-RPE) som rapportert tidligere⁴².
   3. Plate hiPSC-RPEene ved 200 000 celler / cm² på lamininbelagte cellekulturinnsatser med nanofibrøse membraner av poly (L-laktid-co-DL-laktid) med ovale implantasjonsrammer i RPE-medium som inneholder knockout DMEM, 20% knockout serum, 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer, 0,23 mM β-merkaptoetanol, 100 U / ml penicillin, 0,1 mg / ml streptomycin og 10 mM nikotinamid.
   4. Bytt medium annenhver dag, og dyrk hiPSC-RPE i 2 måneder før implantasjon for å oppmuntre polarisert vekst.
4. Implantasjon injektor
   1. Klargjør en plastkapillær med et rektangulært tverrsnitt på 2,8 mm x 0,8 mm ved formblåsing fra et plastrør av OD 1,75 mm / ID 1,10 mm.
   2. Klipp et lastevindu på 4 mm x 2,2 mm i plastkapillæren 6 mm fra enden.
   3. Monter injektoren fra plastkapillæren, et silikonhåndtak, et bladstempel av stål og et stempel (figur 5A).
   4. Sett holderen inn i injektoren gjennom et lastevindu og kast den senere ut i subretinalrommet ved å trykke på stempelet, som beskrevet i trinn 3.5.2 (figur 5B).
5. Forberedelse av den nanofibrøse bæreren og lasting av injektoren
   1. Fyll en liten petriskål av plast med 2 ml fosfatbufret saltvann (PBS). Ta ut en innsats med det forberedte cellelaget, legg det på en halvmyk polystyrenfat, og sentrer den under et lysmikroskop. Bruk en tilpasset modifisert stans for å kutte ut bæreren langs den ovale rammen ved hjelp av et mikroskop. Bæredimensjonene skal være 2 mm x 5 mm.
   2. Bruk en skreddersydd injektor med flatt gjennomsiktig rør for lasting av bæreren; 6 mm fra den distale enden av kapillæren er det et vindu for lasting av bæreren. Fyll injektorens vindu med PBS.
   3. Bruk tangen, slipp prøven fra bunnen av fatet, løft den fra væsken og transporter den til injektorvinduet mens du kontrollerer sideorienteringsmerkene på rammen først for å oppdage oversiden av bæreren med tilhørende celler. En oval ramme letter manipulering med bæreren.
   4. Bruk en tannsonde (et tanninstrument i rustfritt stål med skarp slutt), og plasser bæreren i injektorvinduet. Bruk stempelet til å skyve holderen inn i den lukkede og sikre øvre delen av injektoren. Forbered deretter transportøren for kirurgi.
   5. Kontroller sideretningen til transportøren ved hvert trinn. Losse nanofibrøs bærer fra injektoren ved å skyve metall stempelet.

Figur 4: Nanofibrøs bærer med innebygd PET-ramme. (A) Tre synlige merker på rammen tillater kontroll av bærerens sideretning (hvite piler). (B) Forstørrelsesbilde av PET-rammefragmentet innebygd i den nanofibrøse membranen (hvite piler) på cellebæreren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Implantasjonsinjektor. (A) Deler av injektoren. (B) Nanofibrøs cellebærer med innebygd støttende PET-ramme lastet til den rektangulære plastkapillæren til implantasjonsinjektoren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

3. Kirurgisk prosedyre

1. Kirurgisk utstyr
   1. Bruk følgende kirurgisk utstyr: et oftalmisk kirurgisk mikroskop, et operativsystem for operasjoner på de fremre og bakre øyesegmentene, et ikke-kontakt vitreoretinalt kirurgisk system, en laserfotokoagulasjonsenhet og et digitalt kamera.
      MERK: Standardparametrene som brukes i vitrektomi, ekso- og endokauteri og laserfotokoagulasjonsutstyr er vist i tabell 1.
2. Kirurgiske instrumenter
   1. Steriliser de gjenbrukbare kirurgiske instrumentene med en mobil autoklavdampsterilisator eller lignende i henhold til en standardprotokoll. Engangskirurgiske instrumenter og materialer som kreves under operasjonen er oppført i materialfortegnelsen.
3. Forberedelse for kirurgiske trinn
   1. Etter bedøvelse av dyret som beskrevet i trinn 1.4.1, påfør 1% øyedråper med tropikamidoppløsning og 10% fenylefrinhydrokloridoppløsning i konjunktivalsekken 15 minutter før prosedyren for å provosere legemiddelindusert mydriasis.
   2. Gå til operasjonsbordet med kirurgen i øvre stilling og assistenten i sidestilling (figur 3).
   3. Barber området rundt øyet med en barberhøvel til engangsbruk og fjern det grove smusset.
   4. Desinfiser konjunktivalsekken med 5% povidon-jodoppløsning i 5 minutter.
   5. Desinfiser periorbitalområdet med bomullspinne ved å skrubbe fra øyelokkene til periferien. Gjenta prosessen tre ganger med en 10% povidon-jodløsning og la den virke i 5 minutter.
   6. Dekk operasjonsfeltet med øyet i midten ved hjelp av en standard steril oftalmisk drapering med klebrig gjennomsiktig folie. Flytt øyevippene bort fra øyekulen. Unngå å kutte øyevippene for å redusere risikoen for postoperativ endoftalmitt.
   7. Sett inn lokkspekulumet (Liberman-type eller Cook eye speculum). Eventuelt kan du feste niktiteringsmembranen til huden med 8-0 polyglaktin sutur.
   8. Åpne konjunktivene på nesesiden 2 mm til 3 mm fra limbus for å eksponere sclera for sklerotomiene ved hjelp av kirurgisk tang og Westcott konjunktivsaks.
   9. Sett de tre-valved 25 G trocars 2,5-3 mm fra limbus i området av pars plana (plasser dem klokka 7, 10 og 11). Bruk roterende bevegelser under innføringen på en lett skrå måte (100°-110°) mot bakre netthinne og hold trokaren med tangen (figur 6).
   10. Hold hornhinnen våt eller belegg den med metylcellulose under hele operasjonen for å forhindre osmotisk hornhinneødem.
4. Pars plana vitrektomi (PPV)
   1. Fjern den midterste delen av glasslegemet med standard tre-port pars plana vitrektomi tilnærming. Fjern forsiktig glasslegemet bak linsen i området for fremtidig stor sklerotomi.
   2. Bruk en intravitreal 2-4 mg triamcinolonacetonid (TA) injeksjon (50-100 μL) for å flekke den bakre glasslegemet, som vanligvis forblir festet til netthinnen, for å utføre en kontrollert bakre glasslegemeløsning.
   3. Deretter utfører du sakte en subretinal injeksjon av 0,05-0,1 ml BSS med en 41 G kanyle mer sentralt, og unngår dannelsen av en bleb mot periferien.
   4. Reduser de intraokulære trykkinnstillingene med vanningssystemet ned til 15 mmHg under subretinal injeksjon for å forhindre forbigående retinal vaskulær okklusjon.
   5. Utfør en lineær stor endodiatermi i netthinnen med en 27 G endodiatermisonde 3 mm nær neseblebbasen.
   6. Etterpå lager du en 3 mm stor retinotomi med et 25 G MVR-blad eller vertikal saks med en forhøyet intraokulært trykk (IOP) innstilling av vanningssystemet opp til 60 mmHg i 3 minutter til 5 minutter. Sørg for at det ikke er blødning fra retinotomi, og reduser deretter IOP til 25 mmHg.
   7. Utfør en eksodiatermi av episkleralkarene mellom de to nesebuksene 2,5-3 mm fra limbus med en 27 G endodiatermisonde ved å påføre en mild berøring på overflaten av sclera.
   8. Kontroller væskenivået på infusjonsflasken før forstørring av sklerotomien, som etter sklerotomiforstørrelse er væskeforbruket midlertidig høyt.
   9. Lag en 3,0 mm stor sklerotomi, 3 mm fra limbus, ved hjelp av en 2,75 mm phaco kniv.
   10. Vær oppmerksom på mulig blødning fra skleralkarene og ciliary kroppen inne i den store sklerotomien. Ved blødning, bruk en 27 G endodiatermisonde for å koagulere de skadede karene. Forstørr sklerotomien til 3,0 mm med en satengkniv for å få plass til spissen av injektoren (0,8 mm x 2,8 mm).
   11. Fjern den prolapserte glasslegemet på stedet for den store sklerotomien med en vitrektor. Opprettholde infusjonen av BSS på nivået 25-30 mmHg med vitrektomisystemet for å unngå klodekollaps.
5. Implantasjon av cellebæreren
   1. Sett injektoren forsiktig med den dominerende hånden inn i glasslegemet gjennom den store sklerotomien. Ved motstand, forstørre størrelsen på sklerotomi.
   2. Implanter cellebæreren gjennom retinotomien inn i det subretinale rommet. Bruk om nødvendig en bimanuell teknikk med ekstra sklerotomi og lysekrone lys for å forbedre kontrollen av implantasjonen.
   3. Trekk injektoren fra øyet og lukk den store sklerotomien med en 8-0 polyglaktin sutur for å unngå komplikasjoner forbundet med intraokulær hypotoni.
   4. Utfør en fullstendig væske-luftutveksling (FAX) og drenering av subretinalvæsken med en silikontippet kanyle.
   5. Deretter injiserer du silikonolje (1,000 cSt) i glasslegemet ved hjelp av vitrektomisystemet og slangesystemet for injeksjon av silikonolje til IOP er normal.
6. Intraoperativ avbildning og dokumentasjon
   1. Utfør et videoopptak under hele operasjonen med fotodokumentasjon av de viktigste trinnene i implantasjonen ved hjelp av et videoopptakssystem.
   2. Fullfør fundustegningen ved å dokumentere plasseringen av sklerotomiene, retinotomi, subretinalt implantat og eventuelle komplikasjoner som oppstod ved hjelp av fundustegningsskjemaer.
7. Trinn etter operasjonen
   1. På slutten av operasjonen, fjern trokarene og lukk de tre sklerotomiene og bindehinnen med 8-0 polyglaktin suturer.
   2. Skyll konjunktivalsekken med 5% povidon-jodoppløsning.
   3. Utfør en 0,3 ml subkonjunktival injeksjon på 20 mg gentamicin, 2 mg deksametason og 2% xylokain.
   4. Kontroller tilstanden til fundus og linsen ved hjelp av en mikroskopisk visning.
   5. Fjern suturen(e) fra niktiteringsmembranen ved hjelp av kirurgisk tang og Westcott konjunktivsaks (valgfritt).
   6. Påfør neomycin salve eller ofloxacin oftalmisk salve i konjunktivalsekken.

Figur 6: Innsetting av trocarene i øyet til en minigris . (A) Skjematisk avbildning av trokarene, som settes vinkelrett inn i scleraen mot midten av glasslegemet i det menneskelige øye (grå farge) og på en skrå måte mot bakre netthinne i minigrisøyet (blå farge) for å unngå skade på linsen. Linsen til minipigen (blåfarget) er større enn hos mennesker og i forhold til glasshulestørrelsen. (B) Intraoperativ visning av de innsatte trokarene i en tre-port PPV. Hornhinnen er dekket med metylcellulose for å forhindre tørking og hevelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. Postoperativ behandling

1. Påfør aktuell bacitracin sink / hydrokortisonacetat / neomycinsulfat eller 0,3% ofloksacin i konjunktivalsekken til dyrene fem ganger per dag.
2. Postoperativt, kontroller følgende øyeparametere: turgor av øyets myke vev ved hjelp av palpasjon, inflammatorisk reaksjon på øyets overflate og mysing som en beskyttende reaksjon av øyelokkene ved hjelp av en håndholdt spaltelampe eller indirekte oftalmoskop.
3. For systemisk postoperativ behandling, bruk følgende antibiotika:
   1. Injiser ceftiofurhydroklorid intramuskulært med en dose på 3 mg/kg kroppsvekt (1 ml/kg) på den andre og tredje stabilitetsdagen.
   2. Injiser tulatromycin (1 ml / 40 kg kroppsvekt) etter 72 timer etter kirurgi for forebygging av sekundær bakteriell infeksjon.
4. Utfør en intramuskulær injeksjon av flunixin (2 ml/45 kg levende vekt) og tramadolhydroklorid (100 mg) hver 24. time i 3 dager etter operasjonen for å forhindre smerte.
5. Hold minigrisene i et spesialisert luftkondisjonert anlegg med et temperaturområde på 18-22 ° C og et kunstig 13 t / 11 t lys / mørkt regime.
6. Sørg for at de har fri tilgang til vann og standard fôring (to ganger per dag).

5. Postoperative prosedyrer

1. Postoperative oftalmiske undersøkelser
   1. I den postoperative perioden, kontroller øynene med et indirekte oftalmoskop for tilstedeværelse av betennelse (dvs. rødhet, vevshevelse eller slimbelastning i konjunktivalsekken). Mål det intraokulære trykket i det opererte øyet ved hjelp av palpasjonsmetoden.
2. Postoperativ bildebehandling
   1. Indusere sedasjon i minigrisen ved intramuskulær injeksjon av en TKX-blanding før fundusfotografering og OCT-undersøkelse. Still inn 1% tropikamid og 10% fenylefrinhydroklorid øyedråper i konjunktivalsekken til minigrisen for å indusere mydriasis.
   2. Bruk et lokkspekulum for å opprettholde åpne øyne. For fuktighet av øyeoverflaten og for å oppnå et klart OCT-bilde, vask hornhinnen av dyret med saltoppløsning (0,9% NaCl) hver 30-60 s.
   3. Plasser minigrisen på operasjonsbordet på samme måte som under operasjonen (figur 2B,C, figur 3A). Hovedkravet er å plassere hodet på siden og vinkelrett på skannestykket på OCT-enheten. Bruk styrofoam pads under dyrets snute for å stabilisere hodet, og bringe øyeoverflaten i horisontal stilling.
   4. Samle fargefundusbilder med et ikke-mydriatisk funduskamera i farger, da dette gjør det mulig å dokumentere fremre segment, netthinnen og optisk plate. I tillegg ta et rødfritt bilde av netthinnen med det ikke-mydriatiske funduskameraet.
   5. Utføre optisk koherenstomografiavbildning ved hjelp av OCT-systemet for spektraldomene. Under OCT- eller fundus-avbildningen, vipp minigrisens hode manuelt mot OCT-linsene eller funduskameralinsene for å optimalisere utsikten over den bakre netthinnen og implantasjonsområdet (figur 2C). For optimal avbildning av den implanterte bæreren på fundus, bruk det infrarøde refleksjonslyset til OCT-enheten for å fokusere på implantatet (figur 2C). Bruk modusene OCT-krysslinje og netthinnekartskanning.
   6. Påfør ofloxacin oftalmisk salve ved slutten av undersøkelsen under lokket på dyrets øye.
   7. Flytt minigrisen til innendørsanlegget og observer dens generelle tilstand til slutten av sedasjonen (ca. 2 timer til 5 timer).

6. Enukleasjon av øyet post mortem etter eutanasi

1. Berolig minigrisene med en intramuskulær injeksjon av TKX-blandingen etterfulgt av en intravenøs (gjennom en 22-G ørekanyle) boluspåføring av 1 % propofol (20 ml/dyr) etterfulgt av ekssanguinering. Ikke bruk generelle fikseringsmidler.
2. Ofre dyrene ved ekssanguinering under dyp generell anestesi 7 dager, 14 dager, 28 dager og 42 dager etter celletransplantatimplantasjon.
3. Bruk tang og saks for å fjerne øvre og nedre øyelokk. Fjern det tredje øyelokket og skjær gjennom bindehinden. Klipp øyemuskulaturen og optisk nerve.
4. Enucleate øynene post mortem ved hjelp av kirurgisk saks og kirurgisk tang. Sørg for at prosedyren utføres av en erfaren person.

Discussion

Den subretinale implantasjonen av RPE-celler med forskjellig opprinnelse er en svært lovende trend innen øyeforskning for behandling av retinale degenerative lidelser, som AMD 3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,25 . Hovedideen med denne tilnærmingen er å erstatte de skadede RPEene med sunne RPEer dyrket ex vivo (tilleggsfil 1) 44,45,46,47,48. Bruken av cellebærere for å transplantere de dyrkede RPE-cellene representerer den mest fornuftige tilnærmingen, siden de porøse membranene opprettholder det polariserte RPE-cellelaget i riktig orientering med hensyn til det fotosensoriske laget.

Optimal dyremodell
Et kritisk skritt i å utvikle slike behandlingsmetoder er bruken av den optimale dyremodellen⁴⁹. Tidligere har små og store dyremodeller blitt brukt, inkludert kaniner, hunder, griser og ikke-menneskelige primater 8,9,10,11,12,13,14,15,27,29. I denne artikkelen foreslår vi bruk av Liběchov minigris-modellen og beskriver de preoperative, kirurgiske og postoperative trinnene som muliggjør robuste transplantasjonseffekter. Liběchov minigris ble opprinnelig oppdrettet for rundt 20 år siden og har blitt hyppig brukt i biomedisinsk forskning innen nevrodegenerative sykdommer, som Parkinsons og Huntingtons sykdom^29,50. Siden grisen har en relativt stor hjerne med blodtilførsel og immunologisk respons som ligner på mennesker, har den blitt brukt som dyremodell for allogene transplantasjonseksperimenter også^51,52,53,54. Selv om netthinnen til minipigene ikke har en menneskelignende makula og fovea, inneholder den området centralis og visuelle striper, som er regioner i netthinnen med høy konsentrasjon av kjeglefotoreseptorer³⁰. Den samme størrelsen som det menneskelige øye, tilstedeværelsen av en kegleberiket sentral retina, det velbeskrevne immunsystemet og tilstedeværelsen av metoder for å vurdere morfologien og funksjonen etter operasjonen er viktige argumenter for bruken av denne store dyremodellen i den presenterte studien.

Kirurgisk prosedyre
Så vidt vi vet, finnes det ingen standardiserte og allment aksepterte kirurgiske teknikker for vitreoretinal transplantasjon av RPE-celler på bærere. Et av hovedproblemene med celleutskiftningsterapi er den utfordrende kirurgiske teknikken som har risiko for intraoperative og postoperative komplikasjoner knyttet til retinal detachment, hypotoni, episkleral, choroidal og / eller retinal blødning og høy intraokulær turbulens, noe som kan føre til stillasskader. Postoperativt er det risiko for proliferativ vitreoretinopati, endoftalmitt, hypotoni, netthinneløsning og kataraktdannelse 4,10,13,14,15.

De første studiene på tilnærminger ved bruk av cellebærere ble utført i chinchilla bastard kaniner^13,16,25. Selv om disse dyrene representerer en liten dyremodell, var resultatene som fokuserte på de tekniske aspektene ved operasjonen avgjørende for utviklingen av prosedyrene i store dyremodeller og er derfor oppsummert nedenfor.

En skreddersydd 23 G infusjonskanyle ble opprinnelig brukt med to sideporter for å omdirigere jetstrømmen, noe som bidro til å løse sammenbruddet av bleb og påfølgende retinal detachment¹³. I denne studien la vi ikke merke til noen slik kollaps av bleb. Den mulige årsaken til det kan være den større størrelsen på øyebollet og ytelsen til kjernevitrektomien med spart glasslegeme i periferien på kanyleinfusjonsstedet, noe som kan redusere kraften til den rettede jetstrømmen.

Vanskeligheter under utkastet av cellebæreren fra instrumentet var en annen intraoperativ hindring i smådyrmodellene, som ble kategorisert som "fanget med instrumentet". I tillegg foreslo forfatterne at gjenværende glasslegeme på retinaloverflaten kunne forårsake et bakover "hopp" av bæreren ut av retinotomiåpningen etter implantasjon. Dette problemet kan løses med en enzymassistert vitrektomi, som muliggjør en jevn, kontinuerlig utstøting av cellebæreren i det subretinale rommet. I de fleste tilfeller flyttet forfatterne bæreren for å oppnå en fjernere plassering av implantatet vekk fra retinotomi. I vår kasusserie opplevde vi også en situasjon der cellebæreren forble festet til spissen av injektoren. Det ble imidlertid håndtert ved langsom og forsiktig manipulering av lysrøret og injektorspissen. Vi observerte ingen rester av glasslegemet på retinotomistedet i noen av våre tilfeller. Bruk av TA-assistert PPV i operasjonene kan foreslås som en metode for å redusere risikoen for restfestet glasslegeme. Flere farginger med TA kan være nødvendig for å fjerne det overliggende glasslegemet helt.

I en annen studie ble resultatene av subretinal implantasjon av humane RPE-stamceller dyrket som et polarisert cellulært monolag på en polyestermembran rapportert²⁴. Under forsøkene ble den samme kirurgiske teknikken beskrevet tidligere brukt¹³, men en to-port PPV-tilnærming ble brukt. Til slutt ble en trinnvis protokoll for subretinal implantasjon av cellebærerkirurgi hos kaniner publisert senere²⁵. Denne studien presenterer en svært detaljert og lett repeterbar beskrivelse av det kirurgiske inngrepet, inkludert preoperativ og postoperativ behandling, som også er basert på tidligere erfaringer.

Under bruk av store dyremodeller i etterfølgende studier ble ikke bare tekniske spørsmål adressert, men også spørsmål angående immunreaksjonen til de transplanterte cellene, samt cellebærerstørrelsesrelaterte problemer. En studie med cynomolgusaper (Macaca fascicularis) beskrev resultatene av subretinal implantasjon av humane stamcelleavledede RPE-monolag¹⁵. Alle dyrene gjennomgikk systemisk immunsuppresjon, som besto av sirolimus (startdose på 2 mg, daglig dose på 1 mg) og tetracyklin (7,5 mg^/kg kroppsvekt) med start 7 dager før operasjonen og som varte i 3 måneder etter operasjonen. Den kirurgiske prosedyren ble utført i henhold til protokoller beskrevet tidligere^24,25. Forfatterne brukte en 25 G tre-port PPV-tilnærming med lysekrone endo-belysning. Det er viktig at en TA-assistert PVD ble brukt til å utelukke gjenværende vitreoretinal adhesjon på bakre retina. Som et tillegg til den opprinnelig beskrevne prosedyren fjernet forfatterne verts-RPE-laget i området for fremtidig implantasjon ved hjelp av et 20 G skreddersydd utvidbart sløyfeinstrument.

I vår minigrisstudie brukte vi også systemisk immunsuppresjon. Imidlertid var typen immunosuppresjon forskjellig fra den som er beskrevet ovenfor. Vi administrerte en subkutan injeksjon av takrolimus-eluerende polymermikrosfærer som et depot i en dose på 0,25 mg/kg kroppsvekt for å hindre avstøtning av celletransplantat og inflammatoriske reaksjoner. Vi fjernet ikke RPE-cellelaget under operasjonen, da vårt primære mål var å analysere sikkerheten til prosedyren og levedyktigheten til de implanterte cellene, men ikke deres integrering i vertsnetthinnen.

Tidligere ble sikkerheten og gjennomførbarheten av subretinal implantasjon av et monolag av hESC-avledede RPEer på en sammenleggbar ikke-nedbrytbar maskestøttet submikron parylen-C-membran (6,25 mm x 3,5 mm, 0,4 μm tykk) vurdert hos 14 kvinnelige Yucatán minigriser¹⁰. Etter dyrking ble cellene sådd på en maskestøttet membran. Immunsuppresjon ble utført ved systemisk administrering av takrolimus (ingen regime og dosering indisert) og intravitreale injeksjoner av 0,7 mg av et deksametason implantat ved slutten av kirurgi. PPV ble utført med en 20 G tilnærming. Forfatterne brukte en intravitreal injeksjon av triamcinolonacetonid for bedre visualisering av glasslegemet. Den store sklerotomien var 2 mm til 3 mm stor. Etter subretinal injeksjon ble retina flatt med en midlertidig injeksjon av perfluorkarbonvæske. Etter væske-luftutvekslingen ble det utført en silikonoljetamponade (1000/5000 cSt). Postoperativ behandling inkluderte okulær påføring av deksametason / neomycin / polymyksin B salve 1 uke etter operasjonen. Forfatterne rapporterte en suksessrate på 91% (dvs. effektiv subretinal implantasjon og tilstrekkelige postoperative bildedata). I vår studie ble intravitreal injeksjon av TA-krystaller brukt intraoperativt og hovedsakelig for å visualisere glasslegemet. Den lokale immunsuppressive virkningen av dette legemidlet er imidlertid fortsatt uklar. De nanofibrøse cellebærerne som ble brukt i vår studie var 5,2 mm x 2,1 mm og 3,7 μm tykke, med porestørrelser på 0,4 μm. Under operasjonen utførte vi direkte faks i stedet for å injisere perfluorkarbonvæske. Vår kirurgiske suksessrate (93,1%) var konsistent med og litt bedre enn Koss et ^al.10.

Subretinal transplantasjon av fullt nedbrytbare cellebærere (stillas) for subretinal implantasjon ble først studert i 2019 i Yorkshire^{griser 14}. Studien var hovedsakelig fokusert på de biologisk nedbrytbare egenskapene til fibrinhydrogelimplantater. Forfatterne bemerket at den aggressive immunsuppresjonen som ble brukt på tamgrisene, kunne hemme en lokal inflammatorisk reaksjon som potensielt ble forårsaket under biologisk nedbrytning av fibrinhydrogelimplantatene. De spesifiserte imidlertid ikke hvilken immundempende behandling som ble brukt hos grisene. Under PPV utførte de en 3,6 mm lang sklerotomi for innsetting av subretinal implantasjonsenhet parallelt med og ca. 3,5 mm bakenfor limbus. I tillegg brukte de et pneumatisk drevet injeksjonssystem som tar sikte på å redusere ustabiliteten ved håndplassering forårsaket av fingermanipulering. I vår kasusserie var alle sklerotomiene 2,5 mm til 3,0 mm fra limbus. Den store sklerotomien for innsetting av injektoren var 3 mm lang. Implantasjonsinjektoren som ble brukt i vår studie, ble operert for hånd. Grundig cautery av pars plana i ciliary kroppen og et tilstrekkelig kutt inne i den store sklerotomi synes å være avgjørende for å unngå intraoperative komplikasjoner som iatrogen perifer retinal detachment, blødning og tap av implantatet.

Oppsummert beskriver vi bruken av Liběchov minigris-modellen for transplantasjon av RPE-celler på biologisk nedbrytbare bærere som et behandlingsalternativ for arvelige og ervervede retinale sykdommer. Likheter i øyeanatomi og fysiologi, samt med hensyn til immunsystemet, tillater oss å utvikle og forbedre kirurgiske teknikker og instrumentering for subretinal implantasjon av celler, som lett kan overføres til behandling av humane øyesykdommer. Det er viktig å sikre at operasjoner på minigriser utføres ved hjelp av samme instrumentering (inkludert implantasjonsleveringsverktøy) når de brukes i menneskelige operasjoner, og dermed lette anvendelsen av oppnådd erfaring og kunnskap til mennesker. Alternative storøyde dyremodeller med tilstedeværelse av et makulært område, som ikke-menneskelige primater, kan være nyttige for oppfølging og analyse av de anatomiske og funksjonelle endringene etter subretinal implantasjon i det sentrale retinalområdet. Den detaljerte beskrivelsen av preoperative, kirurgiske og postoperative prosedyrer vil være nyttig for fremtidige studier ved å øke effektiv og standardisert datagenerering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Technical equipment
Wato EX-65 with a Mindray iMEC10	Mindray, Shenzhen, China	Wato Ex-65	anesthesia machine
R-Evolution CR	Optikon, Rome, Italy	R-Evolution CR	phacoemulsifier/vitrectome
Green laser Merilas 532α	Meridian, Thun, Switzerland	Merilas 532α	ophthalmic green laser
Microscope Hi-R NEO 900A	Haag-Streit Surgical, Wedel, Germany)	Hi-R NEO 900A	ophthalmic surgery microscope
Camera Sony PMW-10MD	Sony, Tokyo, Japan	PMW-10MD	full HD medical 2-piece
Non-contact vitreoretinal surgical system MERLIN BIOM	Volk, Mentor, OH, USA	MERLIN BIOM	BIOM
Steam sterilizer	Tuttnauer Europe B.V., Breda, NL	3870 HSG	sterilizer
iCam100	Optovue, Fremont, CA, USA	iCAM100	funduscamera
iVue OCT100-2	Optovue, Fremont, CA, USA	iVue OCT100-2	OCT
Microsurgical instruments and devices
Cook Eye Speculum	Katena, New Jersey, US	K1-5403	15mm blades
Ophthalmology surgical drape	Hylyard, Alpharetta, Georgie, USA	79304	132 x 142cm
Disposable Two step vitrectomy system. (23 gauge/ 0.6 mm)	DORC, Zuidland, Netherlands	1272.ED06
Infusion line for 23G / 0.6 mm infusion cannula	DORC, Zuidland, Netherlands	1279.P
knife 2.75mm, IQ Geometry Tm Slit Knife Angled, Bevel Up	Surgical Specialties Corporation, Reading, USA	72-2761G
Extendible 41G subretinal injection needle. (23 gauge / 0.6 mm)	DORC, Zuidland, Netherlands	1270.EXT
Omnifix 3ml Luer Lock Solo siringe	BBraun, Melsungen, Germany	4617022V	3ml
1ml soft-inject Tuberculin	Henke Sass Wolf, Tuttlingen, Germany	5010.200V0	1ml
8-0 Coated Vicryl	Ethicon, Puerto Rico, USA	J409G
Purified Silicone Oil (in syringe) 10 ml	(FCI, Paris, France)	S5.7170	1000cSt
Pinnacle 360 Morris Vertical Scissors 23Ga	Synergetics, O'Fallon, USA	10.24.23PIN	23Ga
Revolution DSP 23Ga ILM forceps	Alcon, Geneva, Switzerland	706.44	Griesharber revolution
23ga Straight Laser Probe	Synergetics, O’Fallon, USA	55.21.23
FCI Protect 2.0%	FCI Ophthalmics, Paris, France	S5.9100	viscoelastic
DK Westcott style Stitch Scissors, Curve	Duckworth & Kent, Hertfordshire, England	1-501	Curve
Pierse Notched Forceps, 0,3mm Straigh	Duckworth & Kent, Hertfordshire, England	2-100-1E	0,3mm straigh
DK Harms-Tubingen Straight Tying Forceps	Duckworth & Kent, Hertfordshire, England	2-504E	6mm
DK Needle Holder, Straigh	Duckworth & Kent, Hertfordshire, England	3-201	9mm straigh
Medications and solutions
Unitropic 1% gtt.	UNIMED PHARMA spol. s r.o., Bratislava, Slovak republic	tropicamidum 10 mg/ml	eye drops
Diprophos	Merck Sharp & Dohme B.V., Haarlem, Netherlands	betamethasonum 7 mg/ml	1ml
Alcon BSS Irrigation Solution	Alcon, Geneva, Switzerland	balance salt solution (BSS)	500ml
Betaisodona	Mundipharma, Cambridge, United Kingdom	povidon-Iodine 1g/10ml	30ml
Depo-medrol 120mg	Pfizer, New Yourk, USA	methylprednisolon	5ml/200mg
Shotapen	Virbac Carros Cedex, France	benzylpenicillin, dihydrostreptomycin	250ml
Flunixin a.u.v.	Norbrook, Newry, Northern Ireland	flunixinum 50,0 mg	250ml
Tramal 100MG/2ML	Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschland	tramadol	2ml
Zoletil 100	Virbac Carros Cedex, France	tiletamine, zolazepam	100mg
Narkeran 10	Vetoquinol, Magny-Vernois, France	ketamin	2ml
Rometar 20mg/ml	Spofa pharmaceutica, Prague, Czech republic	xylazinum	20mg
Braunol 75mg/g	B.Braun medical, Prague, Czech republic	povidone iodine	75mg/g
Propofol 1% MCT/LCT	Fresenius Kabi, Bad Homburg, Deutschland	propofol	10mg/1ml
Isoflurane 100% Inhalation vapour, liquid	Piramal Critical Care Limited, West Drayton, United Kingdom	isoflurane	100%
Benoxi gtt.  4mg/1ml	Unimed pharma, Bratislava, Slovakia	oxybuprakaine	10ml
Neosynephrin POS 10% gtt.	Ursapharm , Saarbrücken, Deutschland	fenylefrin chloride	10ml
Ophthalmo-framykoin 1X5GM	Zentiva a.s.,  Prague, Czech republic	bacitracin zinc/hydrocortisone acetate/hydrocortisoneacetate/neomycin sulfate	5mg
Floxal ung.	Dr. Gerhard Mann Chem.-Pharm. Fabrik, Berlin, Germany	ofloxacin	0.30%
Eficur inj.	Hipra, Amer, Spain	ceftiofurum hydrochloridum	50mg / 1ml
Draxxin	Zoetis Inc., New Jersey, USA	tulathromycinum	100mg / 1ml
Tramal	Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschland	tramadoli hydrochloridum	100mg / 2ml
Xylapan	Vetoquinol, Magny-Vernois, France	xylazinum	0.4 mg/kg
Proparacaine hydrochlorid ophthalmic solution 0,5%	Bausch&Lomb Incorporated Tampa, FL, USA	Proparacaine hydrochlorid	0.50%
Prograf	Astellas Pharma, Deerfield, Illinois, USA	Tacrolimus powder	1mg
Cell carrier, cultivated cells cultures, and implantation injector
Falcon Cell Culture Inserts	Corning Inc., Kenneburg, ME, USA	353103
TrypLE Express Enzyme (1X)	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	12604021
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	11320033
Biolaminin 521 LN (LN521)	BioLamina, Sundbyberg, Sweden	LN521-02
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	35050061
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	J66742.0B
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich, San Luis, Mi, USA	P4333
CRALBP	Novus Biologicals, Abingdon, UK	NB100-74392
Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific, Germany	21202