Implantación subretiniana de EPR en un portador en minicerdos: pautas para preparaciones preoperatorias, técnicas quirúrgicas y cuidados postoperatorios

Summary

La implantación subretiniana de epitelio pigmentado retiniano (EPR) es uno de los enfoques más prometedores para el tratamiento de enfermedades degenerativas de la retina. Sin embargo, el rendimiento de los estudios preclínicos en modelos animales de ojo grande sigue siendo un desafío. Este informe presenta pautas para el trasplante subretiniano de EPR en un portador de células en minicerdos.

Abstract

Los trastornos degenerativos de la retina (incluida la degeneración macular relacionada con la edad), que se originan principalmente en o dentro de la capa epitelial pigmentada de la retina (EPR), conducen a una desorganización progresiva de la anatomía de la retina y al deterioro de la función visual. La sustitución de células EPR dañadas (EPR) con células EPR cultivadas in vitro utilizando un portador de células subretinianas ha demostrado potencial para restablecer la estructura anatómica de las capas retinianas externas y, por lo tanto, se está estudiando más a fondo. Aquí, presentamos los principios de una técnica quirúrgica que permite el trasplante subretiniano efectivo de un portador de células con EPR cultivados en minicerdos. Las cirugías se realizaron bajo anestesia general e incluyeron una vitrectomía estándar de pars plana (VPP) de tres puertos con preservación de lente, aplicación subretiniana de una solución salina balanceada (BSS), una retinotomía de 2,7 mm, implantación de un portador de células nanofibrosas en el espacio subretiniano a través de una esclerotomía adicional de 3,0 mm, intercambio líquido-aire (FAX), taponamiento de aceite de silicona y cierre de todas las esclerotomías. Este abordaje quirúrgico se utilizó en 29 cirugías (18 animales) en los últimos 8 años con una tasa de éxito del 93,1%. La verificación anatómica de la colocación quirúrgica se realizó mediante imágenes de fondo de ojo in vivo (fotografía de fondo de ojo y tomografía de coherencia óptica). Los pasos quirúrgicos recomendados para la implantación subretiniana de EPR en un portador en ojos de minicerdo se pueden utilizar en futuros estudios preclínicos utilizando modelos animales de ojos grandes.

Introduction

La degeneración macular asociada a la edad (DMAE) es considerada la principal causa de pérdida de la visión central en los países desarrollados y es una de las muchas afecciones relacionadas con la disfunción del epitelio pigmentado de la retina (EPR) ^1,2. El EPR se encuentra en la membrana de Bruch (BM) ubicada basalmente y proporciona el mantenimiento necesario para los fotorreceptores. La degeneración progresiva de la capa RPE es un sello distintivo de la forma atrófica temprana de AMD, y también acompaña el desarrollo de la forma exudativa tardía de AMD también. A pesar de muchos avances en la terapia de la enfermedad de la retina, el desarrollo de una modalidad de tratamiento eficaz sigue siendo un desafío³. Uno de los métodos prometedores es el reemplazo de EPR utilizando una capa de EPR cultivada in vitro. Este tratamiento se asocia con el progreso en la investigación con células madre utilizando EPR derivado de células madre embrionarias humanas (hESC-RPE) y EPR derivado de células madre pluripotentes inducidas (iPSC-RPE)3,4,5,6,7. En los últimos años, muchos grupos de investigación se han centrado en desarrollar diferentes enfoques para el reemplazo de EPR con la prueba de concepto inicialmente aceptada 8,9,10,11,12,13,14,15. Las células del EPR (EPR) generalmente se entregan en el espacio subretiniano en forma de suspensión celular, una lámina celular autoportante o una monocapa celular soportada por un portador artificial 3,16,17,18,19,20,21. La inyección de una suspensión celular es el método más fácil, pero la condición comprometida del BM a menudo puede evitar la unión de las células trasplantadas. Esto puede resultar en una orientación apicobasal incorrecta de los EPR y la falta de formación de una monocapa^22,23. La principal ventaja de los otros dos métodos (es decir, una lámina celular autoportante y una monocapa celular soportada por un sustrato artificial) es que las células ya están en un estado monocapa diferenciado cuando se implantan directamente en el espacio subretiniano²⁴.

Muchas técnicas quirúrgicas que describen la administración de portadores celulares en el espacio subretiniano han sido publicadas en los últimos años 8,9,10,11,12,13,14,15. Estos estudios describieron el uso de modelos animales de ojos grandes, los tipos de portadores celulares, el uso de cultivos celulares trasplantados, los instrumentos de implantación, así como las técnicas quirúrgicas, y los autores se centraron principalmente en los resultados de la implantación subretiniana. En 2015, Popelka et al. informaron el uso de una membrana polimérica electrohilada ultrafina soportada por marco para el trasplante de EPR en ojos de cadáver porcino⁸. La técnica quirúrgica descrita aquí con la implantación subretiniana del portador celular permitió un manejo relativamente preciso del portador y un fácil posicionamiento del andamio en el espacio subretiniano. Kozak et al. evaluaron la viabilidad de la técnica de entrega de un portador con un tamaño aproximado de 2 mm x 5 mm en ojos porcinos⁹. El diseño único del portador celular permitió su correcta colocación, evitando que la monocapa celular se pliegue y se arrugue⁶. Al-Nawaiseh et al. presentaron por primera vez directrices detalladas paso a paso para la implantación de andamios subretinianos en conejos²⁵. Stanzel et al. publicaron un protocolo similar en 2019 para el trasplante en pequeños roedores, conejos, cerdos y primates no humanos²⁶. Como se publicó anteriormente, el trasplante de una monocapa de EPR diferenciada y polarizada en un portador sólido resultó en una mejor supervivencia y una mejor integración del injerto en comparación con otras técnicas de administración (Archivo Suplementario 1)²⁷.

El propósito de cualquier estudio preclínico en animales realizado in vivo es revelar los diversos aspectos de la implantación subretiniana transvítrea quirúrgica de un portador celular con un enfoque en la seguridad del procedimiento, la supervivencia de las células trasplantadas, la respuesta del tejido a las maniobras subretinianas y los resultados postoperatorios a corto y largo plazo. Se ha informado que el uso de ojos porcinos como modelo animal de ojo grande es relevante en términos del alcance de los datos obtenidos, que podrían ser útiles y potencialmente aplicables a los humanos^10,11,14. Nuestro estudio informa sobre la técnica quirúrgica utilizada para la implantación subretiniana in vivo de un portador celular en un modelo animal de ojo grande. Presentamos una descripción detallada de los preparativos preoperatorios, la técnica quirúrgica de implantación de portadores de células subretinianas y el cuidado postoperatorio de los ojos de minicerdo basados en nuestra experiencia en los últimos 8 años. Describimos los principios quirúrgicos básicos que se pueden utilizar para estudios experimentales in vivo que implican la implantación de diferentes tipos de células y portadores celulares.

Modelo animal grande
El rebaño experimental de minicerdos Liběchov fue fundado por la importación de cinco animales de la cepa Hormel de los Estados Unidos en 1967. Estos animales fueron cruzados para estudios de grupos sanguíneos porcinos con varias otras razas o cepas: Landrace, Large White, Cornwall, cerdos vietnamitas y cerdos miniatura de origen de Göttingen^28,29. A los 5 meses de edad y aproximadamente 20 kg de peso corporal (PC), los minipigs alcanzan la madurez sexual. Se informa que la supervivencia de las razas parentales de minipigs (Hormel y Göttingen) es de 12 a 20 años. La implantación subretiniana del portador celular se dirige a la porción central de la retina. La retina de los minipigs carece de mácula y fóvea. Sin embargo, tiene regiones de fotorreceptores de cono altamente concentrados llamados área central y rayas visuales^30,31. Estas regiones son responsables de la mayor agudeza visual.

Las cirugías fueron realizadas por cuatro cirujanos vitreorretinianos experimentados con la asistencia de un asistente experimentado en el centro quirúrgico (TA). Antes de los experimentos in vivo , los cirujanos fueron educados y obtuvieron conocimientos especiales de la anatomía del ojo de minipig, como con respecto a la menor relación de lente a volumen vítreo, la longitud axial más corta (15-19 mm), la ausencia de la membrana de Bowman en la córnea, el volumen vítreo más pequeño (2.8-3.2 mL), la ausencia de la mácula y la fóvea, la ausencia del anillo de Zinn, y el diámetro del disco óptico (vertical/horizontal: 1,5 mm/2,1 mm). En todos los casos, la cirugía se realizó bajo anestesia general en un quirófano especialmente organizado con la implementación de medidas asépticas y antisépticas estándar.

Protocol

Este estudio se adhiere a los principios de las Directrices de la Declaración de Helsinki y los principios éticos para la investigación médica con seres humanos. Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las Directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio y de acuerdo con la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la investigación oftálmica y visual. El protocolo del estudio fue aprobado por la Comisión Profesional de Resorts de la CAS para la Aprobación de Proyectos de Experimentos con Animales en el Instituto de Fisiología y Genética Animal de la Academia Checa de Ciencias (Liběchov, República Checa) (Protocolo aprobado No. 60/2016 y No. 64/2019).

1. Consideraciones durante el trasplante subretiniano de células de un portador en minicerdos

1. Selección de animales
   1. Obtenga y use minicerdos Liběchov que tengan entre 12 y 36 meses de edad, de cualquier sexo y alrededor de 40-80 kg de peso corporal (PC).
   2. Mantenga a los minipigs en el interior en un gallinero con aire acondicionado con temperaturas entre 18-22 °C, exposición a un ciclo artificial de luz/oscuridad de 13 h/11 h, corrales individuales estandarizados, acceso gratuito al agua y alimentación dos veces al día.
2. Preparación previa a la cirugía
   1. Verifique la orientación quirúrgica del ojo y dibuje los esquemas de fondo de ojo. Para ello, divida esquemáticamente la retina de los minipigs en el dibujo del fondo de ojo usando una pluma con una línea vertical en las regiones temporal (desde el disco óptico hacia la oreja), nasal (desde el disco óptico hacia el hocico del cerdo) y central (entre los principales vasos retinianos en el lado nasal) (Figura 1A, B).
   2. Seleccione solo animales sanos sin ninguna patología conductual y neurológica y con calidad normal de la piel, orificios corporales, heces y consumo de alimentos. Haga que un veterinario experto realice la observación clínica y seleccione los animales.
   3. Inyecte por vía intramuscular 3 mg/kg de peso corporal de clorhidrato de ceftiofur (1 ml/kg) el día de la cirugía.
3. Inmunosupresión preoperatoria
   1. Preparar microesferas poliméricas liberadoras de tacrolimus como se describe en Wang et al. y Sevc et al. ^32,33 con modificación.
   2. Asegúrese de que la concentración de tacrolimus en las microesferas poliméricas sea de 51,3 mg/g según lo determinado por HPLC (Tabla de materiales).
   3. Realizar una inyección subcutánea de microesferas poliméricas cargadas con tacrolimus a una dosis de 0,25 mg/kg de peso corporal 6 días antes de la cirugía ocular para impedir el rechazo del injerto celular. Esto se hace para garantizar la supervivencia de las células del donante del EPR humano durante el trasplante xenogénico en los ojos de los minicerdos.
   4. Inyectar los animales por vía intramuscular el día de la cirugía con 80 mg de depo-medrol y bencilpenicilina a 1 mL/10 kg según el peso corporal.
4. Anestesia
   1. Inducir anestesia general con una inyección intramuscular de una mezcla de tiletamina (2 mg/kg), zolazepam (2 mg/kg), ketamina (2 mg/kg) y xilazina (0,4 mg/kg)-TKX^34,35 antes de la cirugía. Verifique la profundidad de la anestesia mediante un estado de inconsciencia y verificando el reflejo pedal (un pellizco de la piel interdigital de la pata trasera), el reflejo corneal (un ligero toque de la córnea), el reflejo pupilar (reacción a la luz) y el reflejo palpebral (un toque en el párpado). Asegúrese de que el animal no parpadee. Confirme la regularidad del ritmo cardíaco y respiratorio.
   2. Después de la inducción de la anestesia, transportar al animal sedado al quirófano en un carro elevador (Figura 2A).
   3. Coloque al animal en la mesa de operaciones en su lado izquierdo para permitir la cirugía en el ojo derecho (Figura 2B).
   4. Realizar el ajuste de la cabeza del animal utilizando almohadillas de espuma de poliestireno para conseguir la posición más adecuada de la retina central para la implantación (es decir, horizontal y paralela al suelo) (Figura 2C).
   5. Coloque gotas oftálmicas de clorhidrato de proparacaína al 0,5% en la solución oftálmica en el saco conjuntival tres veces separadas por 1 minuto para inducir anestesia local.
   6. Insertar una cánula venosa e intubar al animal con un tubo endotraqueal para el mantenimiento por inhalación de la anestesia (isoflurano al 1,5%) utilizando una máquina de anestesia equipada con un monitor de paciente (Figura 2A, B).
   7. Administrar una inyección intramuscular de 1 mL de Eficur por cada 16 kg de peso corporal y 20 mg de Depo-Medrol 1 aproximadamente 15 min antes del inicio de la cirugía ocular (Tabla de materiales).
   8. Mantener la temperatura corporal fisiológica cubriendo al animal con lámina isotérmica y realizar la cirugía como se describe en la sección 3.
   9. Durante la cirugía, controle la temperatura del animal junto con la frecuencia cardíaca y la saturación de oxígeno en la sangre utilizando un clip para la oreja y un monitor del paciente. Evitar la disminución de la temperatura corporal por debajo de 38 °C durante los procedimientos, que se considera un límite seguro³⁶. Mantener la saturación de oxígeno (>96%) y la frecuencia del pulso (70-90 latidos por minuto) durante todo el experimento.
   10. Cuando se complete la cirugía, cierre el flujo de isoflurano y extube al animal.
   11. Después de la respiración espontánea y el despertar, transfiera a los animales a sus corrales.
5. Configuración del quirófano
   1. Organice el quirófano de acuerdo con las necesidades de la cirugía en los ojos del modelo animal de ojo grande (Figura 3A, B). Ajuste la altura de las sillas del cirujano, así como la altura del microscopio, para lograr una posición cómoda para los cirujanos con respecto a la posición del hocico del cerdo.

Figura 1: Dibujo esquemático de las zonas retinianas en minicerdos. (A) Dibujo esquemático de las zonas retinianas en relación con la cabeza del minipig; la elipse amarilla representa el área deseada de implantación subretiniana, T se refiere al área temporal de la retina y N se refiere al área nasal de la retina. (B) Ejemplo del esquema del fondo de ojo después de la implantación subretiniana del portador celular (amarillo) mediante retinotomía (rojo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Transporte y colocación del animal. (A) Transporte del animal sedado al quirófano. (B) Colocación del animal durante la intubación. (C) Ajuste de la cabeza del animal para un acceso óptimo a la retina central durante la cirugía (flecha roja). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: La configuración estándar de la sala de operaciones. (A) Representación esquemática de la posición de los cirujanos (S = cirujano, A = asistente) en relación con la posición de la mesa de operaciones con el minipig, el microscopio quirúrgico (OM), la máquina de vitrectomía (VM), la mesa instrumental (IT) y la máquina de anestesiología (AM). Hay dos posiciones posibles de la máquina de vitrectomía (amarillo y gris). (B) Entorno de la vida real en la sala de operaciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Portador celular, cultivos de células cultivadas e inyector de implantación

1. Portador celular
   1. Corte el marco ovalado de 30 μm de ancho con dimensiones exteriores de 1,7 mm x 4,8 mm, equipado con salientes triangulares ubicados asimétricamente en el marco (Figura 4A), de una lámina de polietileno-tereftalato (PET) de 36 μm de espesor orientada biaxialmente utilizando un láser de femtosegundo.
   2. Preparar una solución polimérica de poli(L-lactida-co-DL-lactida) (LLA/DLLA 90/10, MW 868, 270 g/mol) en piridina a una concentración del 11% en peso con la adición de 2,2 μL de ácido fórmico por 1 g de solución.
   3. Prepare la membrana nanofibrosa con un marco de soporte incrustado (Figura 4B) mediante el electrohilado de la solución polimérica en tres pasos⁸: (1) depositar la primera capa de nanofibras sobre un sustrato de silicio, (2) colocar el marco sobre la capa y (3) depositar la segunda capa de nanofibras.
      NOTA: Deposite cada capa durante 7 minutos para alcanzar un espesor total de membrana de 3,7 μm. Utilice los siguientes parámetros para obtener una membrana compuesta por fibras de 380 nm de espesor y con un tamaño de poro promedio de 0,4 μm y una porosidad de aproximadamente 70%³⁷: una aguja de acero de 20 G, una tensión de 7,1 kV, un espacio de 10 cm, un caudal de 250 μL/min y una temperatura de 25,0 °C ± 0,5 °C.
   4. Retire cuidadosamente la membrana con el marco incrustado del sustrato de silicio y fíjela al cuerpo de un inserto comercial de cultivo celular de 12 pozos desprovisto de la membrana original para facilitar la siembra y el crecimiento de las células.
   5. Tratar la membrana nanofibrosa antes de la siembra celular en aire-plasma durante 30 s a una potencia de 70 W en un limpiador de plasma.
2. Cultivos celulares utilizados para el cultivo en el portador celular
   NOTA: Se pueden utilizar los siguientes portadores celulares: 1) portadores de células nanofibrosas sin células; 2) portadores de células nanofibrosas con EPR humanos primarios (EPR h); 3) portadores de células nanofibrosas con células RPE humanas derivadas de iPSC.
   1. Cultivo de hRPE primarios
   2. Aislar células hRPE primarias de ojos de donantes humanos de acuerdo con una técnica previamente reportada³⁸.
   3. Obtener las células mediante tratamiento enzimático de la retina durante 30 min. Luego, cultive las células hRPE primarias (pasaje 0) durante un máximo de 2 semanas en DMEM / F12 suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS).
   4. Una vez que los cultivos celulares alcancen la confluencia, cambie el medio a FBS al 1% y cultive durante 30 días adicionales.
   5. Sembrar los hRPE primarios en placas trans-pocillo y en un portador de células nanofibrosas recubierto de laminina a una densidad de 2.000 células/mm². Después de otros 30 días de incubación en FBS al 1%, utilice los portadores celulares con hRPE primarios para la implantación subretiniana en minicerdos.
3. RPE derivados de iPSC humanos
   1. Utilizar hiPSCs derivadas de fibroblastos derivados de pacientes con retinitis pigmentosa asociada a MERTK³⁹ que se corrigen genéticamente en dos alelos utilizando el sistema CRISPR/Cas9 (RP1-FiPS4F1-GC2)⁴⁰, así como hiPSCs derivadas de los fibroblastos de un sujeto sano (Ctrl2-FiPS5F2)⁴¹ que se utilizan como control.
   2. Generar y posteriormente diferenciar ambas líneas celulares hiPSCs hacia células EPR (hiPSC-RPE) como se informó anteriormente⁴².
   3. Colocar en placa los hiPSC-RPEs a 200.000 células/^cm2 en insertos de cultivo celular recubiertos con laminina con membranas nanofibrosas de poli(L-lactida-co-DL-lactida) con marcos de implantación ovalados en medio RPE que contiene DMEM knockout, 20% de suero knockout, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 0,23 mM β-mercaptoetanol, 100 U/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina y 10 mM de nicotinamida.
   4. Cambie el medio cada dos días y cultive el hiPSC-RPE durante 2 meses antes de la implantación para estimular el crecimiento polarizado.
4. Inyector de implantación
   1. Preparar un capilar de plástico con una sección transversal rectangular de 2,8 mm x 0,8 mm mediante moldeo por soplado a partir de un tubo de plástico de OD 1,75 mm/ID 1,10 mm.
   2. Corte una ventana de carga de 4 mm x 2,2 mm en el capilar de plástico a 6 mm del extremo.
   3. Ensamble el inyector a partir del capilar de plástico, un mango de silicona, un émbolo de cuchillas de acero y un pistón (Figura 5A).
   4. Cargue el portador en el inyector a través de una ventana de carga y luego expulsarlo al espacio subretiniano empujando el émbolo, como se describe en el paso 3.5.2 (Figura 5B).
5. Preparación del portador nanofibroso y carga del inyector
   1. Llene una pequeña placa de Petri de plástico con 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Saque un inserto con la capa celular preparada, colóquelo en un plato de poliestireno semiblando y céntrelo bajo un microscopio óptico. Use un punzón modificado a medida para cortar el portador a lo largo del marco ovalado con un microscopio. Las dimensiones del portador deben ser de 2 mm x 5 mm.
   2. Utilice un inyector hecho a medida con tubo plano transparente para cargar el transportador; A 6 mm del extremo distal del capilar, hay una ventana para cargar el portador. Llene la ventana del inyector con PBS.
   3. Usando los fórceps, suelte la muestra del fondo del plato, levántela del líquido y transpórtela a la ventana del inyector mientras verifica primero las marcas de orientación lateral en el marco para detectar primero la parte superior del portador con células adherentes. Un marco ovalado facilita la manipulación con el portador.
   4. Usando una sonda dental (un instrumento dental de acero inoxidable con un extremo afilado), coloque el portador en la ventana del inyector. Use el émbolo para empujar el portador hacia la parte superior cerrada y segura del inyector. Luego, prepare al portador para la cirugía.
   5. Compruebe la orientación lateral del transportín en cada paso. Descargue el portador nanofibroso del inyector empujando el émbolo metálico.

Figura 4: Portador nanofibroso con un marco de PET de soporte incorporado. (A) Tres marcas visibles en el marco permiten controlar la orientación lateral del portador (flechas blancas). (B) Vista de ampliación del fragmento de marco de PET incrustado en la membrana nanofibrosa (flechas blancas) del portador celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Inyector de implantación . (A) Partes del inyector. (B) Portador de células nanofibrosas con marco de PET de soporte incorporado cargado en el capilar rectangular de plástico del inyector de implantación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Procedimiento quirúrgico

1. Equipo quirúrgico
   1. Utilice el siguiente equipo quirúrgico: un microscopio quirúrgico oftálmico, un sistema operativo para cirugías en los segmentos ocular anterior y posterior, un sistema quirúrgico vitreorretiniano sin contacto, un dispositivo de fotocoagulación con láser y una cámara digital.
      NOTA: Los parámetros estándar utilizados en vitrectomía, exocauterización y endocauterización y equipos de fotocoagulación con láser se representan en la Tabla 1.
2. Instrumentos quirúrgicos
   1. Esterilice los instrumentos quirúrgicos reutilizables con un esterilizador de vapor de autoclave móvil o similar de acuerdo con un protocolo estándar. Los instrumentos quirúrgicos de un solo uso y los materiales requeridos durante la cirugía se enumeran en la Tabla de materiales.
3. Preparación para los pasos quirúrgicos
   1. Después de anestesiar al animal como se describe en el paso 1.4.1, aplique gotas oftálmicas de solución de tropicamida al 1% y solución de clorhidrato de fenilefrina al 10% en el saco conjuntival 15 min antes del procedimiento para provocar midriasis inducida por fármacos.
   2. Acérquese a la mesa de operaciones con el cirujano en la posición superior y el asistente en la posición lateral (Figura 3).
   3. Afeite el área alrededor del ojo con una maquinilla de afeitar de un solo uso y retire la suciedad áspera.
   4. Desinfecte el saco conjuntival con una solución de povidona yodada al 5% durante 5 min.
   5. Desinfecte el área periorbitaria con hisopos de algodón frotando desde los párpados hasta la periferia. Repita el proceso tres veces con una solución de povidona yodada al 10% y déjelo actuar durante 5 minutos.
   6. Cubra el campo de operación con el ojo en el medio usando una cortina oftálmica estéril estándar con lámina transparente pegajosa. Aleja las pestañas del globo ocular. Evite cortar las pestañas para reducir el riesgo de endoftalmitis postoperatoria.
   7. Inserte el espéculo de la tapa (espéculo tipo Liberman o Ojo de cocinero). Opcionalmente, fije la membrana nictitante a la piel con 8-0 Sutura de poliglactina.
   8. Abra la conjuntiva en el lado nasal de 2 mm a 3 mm del limbo para exponer la esclerótica para las esclerotomías usando fórceps quirúrgicos y tijeras conjuntivales de Westcott.
   9. Inserte los trócares 25 G de tres válvulas a 2.5-3 mm del limbo en el área de la pars plana (colóquelos a las 7 en punto, 10 en punto y 11 en punto). Utilice movimientos giratorios durante la inserción de manera ligeramente oblicua (100°-110°) hacia la retina posterior y sujete el trócar con los fórceps (Figura 6).
   10. Mantenga la córnea húmeda o cúbrala con metilcelulosa durante toda la cirugía para prevenir el edema corneal osmótico.
4. Vitrectomía de la pars plana (VPP)
   1. Extirpar la porción media del cuerpo vítreo con el enfoque estándar de vitrectomía de la pars plana de tres puertos. Retire con cuidado el vítreo detrás de la lente en el área de la futura esclerotomía grande.
   2. Utilizar una inyección intravítrea de 2-4 mg de acetónido de triamcinolona (AT) (50-100 μL) para teñir el vítreo posterior, que suele permanecer adherido a la retina, con el fin de realizar un desprendimiento vítreo posterior controlado.
   3. Después de eso, realice lentamente una inyección subretiniana de 0.05-0.1 mL de BSS con una cánula de 41 G más centralmente, evitando la formación de una ampolla hacia la periferia.
   4. Reducir los ajustes de presión intraocular con el sistema de irrigación hasta 15 mmHg durante la inyección subretiniana para evitar una oclusión vascular retiniana transitoria.
   5. Realizar una endodiatermia lineal grande de la retina con una sonda de endodiatermia 27 G de 3 mm cerca de la base de la ampolla nasal.
   6. Después, realice una retinotomía grande de 3 mm con una cuchilla MVR de 25 G o tijeras verticales con un ajuste de presión intraocular elevada (PIO) del sistema de irrigación hasta 60 mmHg durante 3 min a 5 min. Asegúrese de que no haya sangrado por la retinotomía y luego reduzca la PIO a 25 mmHg.
   7. Realizar una exodiatermia de los vasos epiesclerales entre los dos trócares nasales a 2,5-3 mm del limbo con una sonda de endodiatermia de 27 G aplicando un toque suave sobre la superficie de la esclerótica.
   8. Compruebe el nivel de líquido del frasco de infusión antes de agrandar la esclerotomía, ya que después del agrandamiento de la esclerotomía, el consumo de líquidos es temporalmente alto.
   9. Realice una esclerotomía grande de 3,0 mm, a 3 mm del limbo, utilizando un cuchillo phaco de 2,75 mm.
   10. Preste atención a un posible sangrado de los vasos esclerales y el cuerpo ciliar dentro de la esclerotomía grande. En caso de sangrado, utilice una sonda de endodiatermia de 27 G para coagular los vasos dañados. Amplíe la esclerotomía a 3,0 mm con un cuchillo de satén para acomodar la punta del inyector (0,8 mm x 2,8 mm).
   11. Retire el cuerpo vítreo prolapsado en el sitio de la esclerotomía grande con un vitrector. Mantener la infusión de BSS al nivel de 25-30 mmHg con el sistema de vitrectomía para evitar el colapso del globo.
5. Implantación del portador celular
   1. Inserte suavemente el inyector con la mano dominante en la cavidad vítrea a través de la esclerotomía grande. En caso de resistencia, ampliar el tamaño de la esclerotomía.
   2. Implante el portador de células a través de la retinotomía en el espacio subretiniano. Si es necesario, utilice una técnica bimanual con esclerotomía adicional y lámpara de araña para mejorar el control de la implantación.
   3. Retire el inyector del ojo y cierre la esclerotomía grande con un 8-0 Sutura de poliglactina para evitar complicaciones asociadas con hipotonía intraocular.
   4. Realice un intercambio completo de fluido-aire (FAX) y drenaje del líquido subretiniano con una cánula con punta de silicona.
   5. Después de eso, inyecte aceite de silicona (1,000 cSt) en la cavidad vítrea utilizando el sistema de vitrectomía y el sistema de tubos para la inyección de aceite de silicona hasta que la PIO sea normal.
6. Imágenes y documentación intraoperatoria
   1. Realice una grabación de video durante toda la cirugía con documentación fotográfica de los pasos clave de la implantación utilizando un sistema de grabación de video.
   2. Complete el dibujo del fondo de ojo documentando la ubicación de las esclerotomías, la retinotomía, el implante subretiniano y cualquier complicación que haya ocurrido utilizando esquemas de dibujo de fondo de ojo.
7. Pasos posteriores a la cirugía
   1. Al final de la cirugía, retire los trócares y cierre las tres esclerotomías y la conjuntiva con 8-0 Suturas de poliglactina.
   2. Enjuague el saco conjuntival con una solución de povidona yodada al 5%.
   3. Realizar una inyección subconjuntival de 0,3 ml de 20 mg de gentamicina, 2 mg de dexametasona y xilococaína al 2%.
   4. Compruebe el estado del fondo de ojo y del cristalino mediante una vista microscópica.
   5. Retire la(s) sutura(s) de la membrana nictitante usando fórceps quirúrgicos y tijeras conjuntivales de Westcott (opcional).
   6. Aplique ungüento de neomicina o ungüento ofoftálmico de ofloxacino en el saco conjuntival.

Figura 6: Inserción de los trócares en el ojo de un minipig. (A) Representación esquemática de los trócares, que se insertan perpendicularmente en la esclerótica hacia el centro de la cavidad vítrea en el ojo humano (color gris) y de manera oblicua hacia la retina posterior en el ojo de minipig (color azul) para evitar daños en el cristalino. La lente del minipig (de color azul) es más grande que la de los humanos y relativa al tamaño de la cavidad vítrea. (B) Vista intraoperatoria de los trócares insertados en un PPV de tres puertos. La córnea está cubierta con metilcelulosa para evitar la sequedad y la hinchazón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Cuidados postoperatorios

1. Aplique bacitracina zinc tópica / acetato de hidrocortisona / sulfato de neomicina o 0.3% de ofloxacino en el saco conjuntival de los animales cinco veces al día.
2. Después de la operación, verifique los siguientes parámetros oculares: turgencia de los tejidos blandos del ojo mediante palpación, reacción inflamatoria en la superficie del ojo y entrecerrar los ojos como reacción protectora de los párpados con una lámpara de hendidura de mano o un oftalmoscopio indirecto.
3. Para la atención postoperatoria sistémica, use los siguientes antibióticos:
   1. Inyecte por vía intramuscular clorhidrato de ceftiofur a la dosis de 3 mg/kg de peso corporal (1 ml/kg) el segundo y tercer día de estabilidad.
   2. Inyectar tulatromicina (1 mL/40 kg pc) después de 72 h después de la cirugía para la prevención de la infección bacteriana secundaria.
4. Realizar una inyección intramuscular de flunixina (2 mL/45 kg de peso vivo) y clorhidrato de tramadol (100 mg) cada 24 h durante 3 días después de la cirugía para prevenir el dolor.
5. Mantener a los minipigs en una instalación especializada con aire acondicionado con un rango de temperatura de 18-22 °C y un régimen artificial de luz/oscuridad de 13 h/11 h.
6. Asegúrese de que tengan acceso gratuito al agua y a la alimentación estándar (dos veces al día).

5. Procedimientos postoperatorios

1. Exámenes oftalmológicos postoperatorios
   1. En el período postoperatorio, inspeccione los ojos con un oftalmoscopio indirecto para detectar la presencia de inflamación (es decir, enrojecimiento, hinchazón de los tejidos o congestión de moco en el saco conjuntival). Medir la presión intraocular en el ojo operado mediante el método de palpación.
2. Imagen postoperatoria
   1. Inducir la sedación en el minipig mediante la inyección intramuscular de una mezcla TKX antes de la fotografía de fondo de ojo y el examen de OCT. Instilar gotas oftálmicas de clorhidrato de tropicamida al 1% y clorhidrato de fenilefrina al 10% en el saco conjuntival del minicerdo para inducir midriasis.
   2. Emplee un espéculo de párpado para mantener los ojos abiertos. Para hidratar la superficie ocular y obtener una imagen clara de OCT, lavar la córnea del animal con solución salina (0,9% NaCl) cada 30-60 s.
   3. Coloque el minipig en la mesa de operaciones de la misma manera que durante la operación (Figura 2B, C, Figura 3A). El requisito principal es colocar la cabeza en el costado y perpendicular a la pieza de escaneo del dispositivo OCT. Use almohadillas de espuma de poliestireno debajo del hocico del animal para estabilizar la cabeza, llevando la superficie del ojo a una posición horizontal.
   4. Recopile imágenes de fondo de ojo en color con una cámara de fondo de ojo no midriático en color, ya que esto permite documentar el segmento anterior, la retina y el disco óptico. Además, tome una imagen libre de rojo de la retina con la cámara de fondo de ojo no midriático.
   5. Realizar imágenes de tomografía de coherencia óptica utilizando el sistema OCT de dominio espectral. Durante la OCT o la imagen del fondo de ojo, incline la cabeza del minipig manualmente hacia las lentes OCT o las lentes de la cámara del fondo de ojo para optimizar la vista de la retina posterior y el área de implantación (Figura 2C). Para obtener imágenes óptimas del portador implantado en el fondo, aplique la luz de reflectancia infrarroja del dispositivo OCT para enfocar el implante (Figura 2C). Utilice los modos de escaneo de línea cruzada y mapa de retina de OCT.
   6. Aplique ungüento ofloxacina oftálmico al final del examen debajo del párpado del ojo del animal.
   7. Trasladar el minipig a la instalación interior y observar su estado general hasta el final de la sedación (aproximadamente 2 h a 5 h).

6. Enucleación de la autopsia del ojo después de la eutanasia

1. Sedar a los minicerdos con una inyección intramuscular de la mezcla TKX seguida de una aplicación intravenosa (a través de una cánula de oído 22-G) de propofol al 1% (20 mL/animal) seguida de exsanguición. No utilice fijadores generales.
2. Sacrificar a los animales por exsanguinación durante la anestesia general profunda 7 días, 14 días, 28 días y 42 días después de la implantación del injerto celular.
3. Use fórceps y tijeras para quitar los párpados superiores e inferiores. Retire el tercer párpado y corte a través de la conjuntiva. Cortar los músculos del ojo y el nervio óptico.
4. Enuclear los ojos post mortem usando tijeras quirúrgicas y fórceps quirúrgicos. Asegúrese de que el procedimiento sea realizado por una persona experimentada.

Discussion

La implantación subretiniana de células del EPR con diferentes orígenes es una tendencia muy prometedora en la investigación ocular para el tratamiento de trastornos degenerativos retinianos, como la DMAE 3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,25 . La idea principal de este enfoque es sustituir los EPR dañados por EPR sanos cultivados ex vivo (Archivo Suplementario 1)44,45,46,47,48. El uso de portadores celulares para trasplantar las células RPE cultivadas representa el enfoque más razonable, ya que las membranas porosas mantienen la capa celular RPE polarizada en la orientación correcta con respecto a la capa fotosensorial.

Modelo animal óptimo
Un paso crítico en el desarrollo de tales enfoques de tratamiento es el uso del modelo animal óptimo⁴⁹. En el pasado, se han utilizado modelos de animales pequeños y grandes, incluidos conejos, perros, cerdos y primates no humanos 8,9,10,11,12,13,14,15,27,29. En este artículo, proponemos el uso del modelo de minicerdo de Liběchov y describimos los pasos preoperatorios, quirúrgicos y postoperatorios que permiten una eficacia robusta del trasplante. El minicerdo Liběchov fue criado originalmente hace unos 20 años y se ha utilizado con frecuencia en la investigación biomédica en el campo de las enfermedades neurodegenerativas, como el Parkinson y la enfermedad de Huntington^29,50. Dado que el cerdo posee un cerebro relativamente grande con un suministro de sangre y una respuesta inmunológica similar a los de los humanos, también se ha utilizado como modelo animal para experimentos de trasplante alogénico^51,52,53,54. A pesar de que la retina de los minipigs no posee una mácula y fóvea de tipo humano, contiene el área central y las rayas visuales, que son regiones de la retina con una alta concentración de fotorreceptores de cono³⁰. El tamaño similar al ojo humano, la presencia de una retina central enriquecida con conos, el sistema inmune bien descrito y la presencia de métodos para evaluar la morfología y la función después de la cirugía son argumentos importantes para el uso de este modelo animal grande en el estudio presentado.

Procedimiento quirúrgico
Hasta donde sabemos, no existen técnicas quirúrgicas estandarizadas y ampliamente aceptadas para el trasplante vitreorretiniano de células EPR en portadores. Uno de los problemas clave de la terapia de reemplazo celular es la técnica quirúrgica desafiante que tiene un riesgo de complicaciones intraoperatorias y postoperatorias relacionadas con el desprendimiento de retina, hipotonía, sangrado epiescleral, coroideo y / o retiniano, y alta turbulencia intraocular, que puede conducir a daños en el andamio. En el postoperatorio, existe riesgo de vitreorretinopatía proliferativa, endoftalmitis, hipotonía, desprendimiento de retina y formación de cataratas 4,10,13,14,15.

Los primeros estudios sobre aproximaciones con portadores celulares fueron realizados en conejos bastardos chinchilla^13,16,25. A pesar de que estos animales representan un modelo animal pequeño, los resultados centrados en los aspectos técnicos de la cirugía fueron cruciales en el desarrollo de los procedimientos en modelos animales grandes y, por lo tanto, se resumen a continuación.

Inicialmente se utilizó una cánula de infusión de 23 G hecha a medida con dos puertos laterales para redirigir la corriente en chorro, lo que ayudó a resolver el colapso de la ampolla y el consecuente desprendimiento de retina¹³. En el presente estudio, no notamos tal colapso de la ampolla. La posible razón de esto podría ser el mayor tamaño del globo ocular y el rendimiento de la vitrectomía central con vítreo preservado en la periferia en el sitio de infusión de la cánula, lo que podría reducir la fuerza de la corriente en chorro dirigida.

Las dificultades durante la eyección del portador celular del instrumento fueron otro obstáculo intraoperatorio en los modelos de animales pequeños, que fueron categorizados como "atrapados con el instrumento". Además, los autores sugirieron que el vítreo residual en la superficie de la retina podría causar un "salto" hacia atrás del portador fuera del orificio de la retinotomía después de la implantación. Este problema se puede resolver con una vitrectomía asistida por enzimas, que permite una expulsión suave y continua del portador celular en el espacio subretiniano. En la mayoría de los casos, los autores reposicionaron al portador para obtener una ubicación más distante del implante lejos de la retinotomía. En nuestra serie de casos, también experimentamos una situación en la que el portador celular permaneció unido a la punta del inyector. Sin embargo, eso se logró mediante una manipulación lenta y suave del tubo de luz y la punta del inyector. No observamos ningún vítreo residual en el sitio de la retinotomía en ninguno de nuestros casos. El uso de VPP asistido por AATT en las cirugías se puede sugerir como un método para reducir el riesgo de vítreo adherido residualmente. Puede ser necesaria una tinción múltiple con TA para eliminar completamente el vítreo suprayacente.

En un estudio diferente, los resultados de la implantación subretiniana de células madre del EPR humano cultivadas como una monocapa celular polarizada en una membrana de poliéster fueron reportados²⁴. Durante los experimentos, se utilizó la misma técnica quirúrgica descrita anteriormente¹³, pero se aplicó un enfoque PPV de dos puertos. Finalmente, posteriormente se publicó un protocolo paso a paso para la implantación subretiniana de cirugía de portadores celulares en conejos²⁵. Este estudio presenta una descripción muy detallada y fácilmente repetible del procedimiento quirúrgico, incluyendo la atención preoperatoria y postoperatoria, que también se basan en la experiencia previa.

Durante el uso de modelos animales grandes en estudios posteriores, no solo se abordaron cuestiones técnicas, sino también preguntas relacionadas con la reacción inmune a las células trasplantadas, así como cuestiones relacionadas con el tamaño del portador celular. Un estudio con monos cynomolgus (Macaca fascicularis) describió los resultados de la implantación subretiniana de monocapas de EPR derivadas de células madre humanas¹⁵. Todos los animales se sometieron a inmunosupresión sistémica, que consistió en sirolimus (dosis de carga de 2 mg, dosis diaria de 1 mg) y tetraciclina (7,5 mg/kg^- PC) comenzando 7 días antes de la cirugía y durando 3 meses después de la cirugía. El procedimiento quirúrgico fue realizado de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente^24,25. Los autores utilizaron un enfoque PPV de tres puertos 25 G con endo-iluminación de araña. Es importante destacar que se utilizó una PVD asistida por AATT para excluir la adhesión vitreorretiniana residual en la retina posterior. Como una adición al procedimiento descrito originalmente, los autores eliminaron la capa de RPE del huésped en el área de implantación futura utilizando un instrumento de bucle extensible hecho a medida de 20 G.

En nuestro estudio de minipigs, también utilizamos inmunosupresión sistémica. Sin embargo, el tipo de inmunosupresión difería del descrito anteriormente. Administramos una inyección subcutánea de microesferas poliméricas liberadoras de tacrolimus como depósito a una dosis de 0,25 mg/kg de peso corporal para dificultar el rechazo del injerto celular y las reacciones inflamatorias. No eliminamos la capa de células EPR huésped durante la cirugía, ya que nuestro objetivo principal era analizar la seguridad del procedimiento y la viabilidad de las células implantadas, pero no su integración en la retina del huésped.

Previamente, se evaluó la seguridad y viabilidad de la implantación subretiniana de una monocapa de EPR derivados de hESC en una membrana submicrónica de parileno-C plegable no degradable soportada por malla (6.25 mm x 3.5 mm, 0.4 μm de espesor) en 14 minicerdos hembras de Yucatán¹⁰. Después del cultivo, las células se sembraron en una membrana soportada por malla. La inmunosupresión se realizó mediante la administración sistémica de tacrolimus (sin régimen y dosis indicadas) e inyecciones intravítreas de 0,7 mg de un implante de dexametasona al final de la cirugía. El VPP se realizó con un enfoque de 20 G. Los autores utilizaron una inyección intravítrea de acetónido de triamcinolona para una mejor visualización del cuerpo vítreo. La esclerotomía grande fue de 2 mm a 3 mm de tamaño. Después de la inyección subretiniana, la retina se aplanó con una inyección temporal de líquido de perfluorocarbono. Después del intercambio fluido-aire, se realizó un taponamiento de aceite de silicona (1.000/5.000 cSt). El cuidado postoperatorio incluyó la aplicación ocular de pomada de dexametasona/neomicina/polimixina B 1 semana después de la cirugía. Los autores informaron una tasa de éxito del 91% (es decir, implantación subretiniana eficiente y suficientes datos de imágenes postoperatorias). En nuestro estudio, la inyección intravítrea de cristales de TA se utilizó intraoperatoriamente y principalmente para visualizar el cuerpo vítreo. Sin embargo, la acción inmunosupresora local de este fármaco sigue sin estar clara. Los portadores de células nanofibrosas utilizados en nuestro estudio fueron de 5,2 mm x 2,1 mm y 3,7 μm de espesor, con tamaños de poro de 0,4 μm. Durante la cirugía, realizamos FAX directo en lugar de inyectar líquido de perfluorocarbono. Nuestra tasa de éxito quirúrgico (93,1%) fue consistente y ligeramente mejor que la de Koss et ^al.10.

El trasplante subretiniano de portadores de células totalmente degradables (andamio) para implantación subretiniana se estudió por primera vez en 2019 en cerdos de Yorkshire¹⁴. El estudio se centró principalmente en las características biodegradables de los implantes de hidrogel de fibrina. Los autores señalaron que la inmunosupresión agresiva utilizada en los cerdos domésticos podría inhibir una reacción inflamatoria local potencialmente causada durante la biodegradación de los implantes de hidrogel de fibrina. Sin embargo, no especificaron la terapia inmunosupresora utilizada en los cerdos. Durante la VPP, realizaron una esclerotomía de 3,6 mm de longitud para la inserción del dispositivo de implantación subretiniana paralelo y aproximadamente 3,5 mm posterior al limbo. Además, utilizaron un sistema de inyección neumático con el objetivo de reducir la inestabilidad de la colocación de la mano causada por la manipulación de los dedos. En nuestra serie de casos, todas las esclerotomías fueron de 2,5 mm a 3,0 mm del limbo. La esclerotomía grande para la inserción del inyector fue de 3 mm de largo. El inyector de implantación utilizado en nuestro estudio fue operado a mano. La cauterización completa de la pars plana del cuerpo ciliar y un corte suficiente dentro de la esclerotomía grande parecen ser cruciales para evitar complicaciones intraoperatorias como el desprendimiento de retina periférica iatrogénica, el sangrado y la pérdida del implante.

En resumen, describimos el uso del modelo de minicerdo de Liběchov para el trasplante de células del EPR en portadores biodegradables como una opción de tratamiento para enfermedades retinianas hereditarias y adquiridas. Las similitudes en la anatomía y fisiología ocular, así como con respecto al sistema inmunológico, nos permiten desarrollar y mejorar las técnicas quirúrgicas y la instrumentación para la implantación subretiniana de células, que pueden transferirse fácilmente al tratamiento de trastornos oculares humanos. Es importante asegurarse de que las cirugías en minicerdos se realicen utilizando la misma instrumentación (incluidas las herramientas de administración de implantación) cuando se utilizan en cirugías humanas, facilitando así la aplicación de la experiencia y los conocimientos adquiridos a los humanos. Los modelos alternativos de animales de ojo grande con presencia de un área macular, como los primates no humanos, podrían ser útiles para el seguimiento y análisis de los cambios anatómicos y funcionales después de la implantación subretiniana en el área central de la retina. La descripción detallada de los procedimientos de atención preoperatoria, quirúrgica y postoperatoria será útil para estudios futuros al aumentar la generación de datos eficiente y estandarizada.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Technical equipment
Wato EX-65 with a Mindray iMEC10	Mindray, Shenzhen, China	Wato Ex-65	anesthesia machine
R-Evolution CR	Optikon, Rome, Italy	R-Evolution CR	phacoemulsifier/vitrectome
Green laser Merilas 532α	Meridian, Thun, Switzerland	Merilas 532α	ophthalmic green laser
Microscope Hi-R NEO 900A	Haag-Streit Surgical, Wedel, Germany)	Hi-R NEO 900A	ophthalmic surgery microscope
Camera Sony PMW-10MD	Sony, Tokyo, Japan	PMW-10MD	full HD medical 2-piece
Non-contact vitreoretinal surgical system MERLIN BIOM	Volk, Mentor, OH, USA	MERLIN BIOM	BIOM
Steam sterilizer	Tuttnauer Europe B.V., Breda, NL	3870 HSG	sterilizer
iCam100	Optovue, Fremont, CA, USA	iCAM100	funduscamera
iVue OCT100-2	Optovue, Fremont, CA, USA	iVue OCT100-2	OCT
Microsurgical instruments and devices
Cook Eye Speculum	Katena, New Jersey, US	K1-5403	15mm blades
Ophthalmology surgical drape	Hylyard, Alpharetta, Georgie, USA	79304	132 x 142cm
Disposable Two step vitrectomy system. (23 gauge/ 0.6 mm)	DORC, Zuidland, Netherlands	1272.ED06
Infusion line for 23G / 0.6 mm infusion cannula	DORC, Zuidland, Netherlands	1279.P
knife 2.75mm, IQ Geometry Tm Slit Knife Angled, Bevel Up	Surgical Specialties Corporation, Reading, USA	72-2761G
Extendible 41G subretinal injection needle. (23 gauge / 0.6 mm)	DORC, Zuidland, Netherlands	1270.EXT
Omnifix 3ml Luer Lock Solo siringe	BBraun, Melsungen, Germany	4617022V	3ml
1ml soft-inject Tuberculin	Henke Sass Wolf, Tuttlingen, Germany	5010.200V0	1ml
8-0 Coated Vicryl	Ethicon, Puerto Rico, USA	J409G
Purified Silicone Oil (in syringe) 10 ml	(FCI, Paris, France)	S5.7170	1000cSt
Pinnacle 360 Morris Vertical Scissors 23Ga	Synergetics, O'Fallon, USA	10.24.23PIN	23Ga
Revolution DSP 23Ga ILM forceps	Alcon, Geneva, Switzerland	706.44	Griesharber revolution
23ga Straight Laser Probe	Synergetics, O’Fallon, USA	55.21.23
FCI Protect 2.0%	FCI Ophthalmics, Paris, France	S5.9100	viscoelastic
DK Westcott style Stitch Scissors, Curve	Duckworth & Kent, Hertfordshire, England	1-501	Curve
Pierse Notched Forceps, 0,3mm Straigh	Duckworth & Kent, Hertfordshire, England	2-100-1E	0,3mm straigh
DK Harms-Tubingen Straight Tying Forceps	Duckworth & Kent, Hertfordshire, England	2-504E	6mm
DK Needle Holder, Straigh	Duckworth & Kent, Hertfordshire, England	3-201	9mm straigh
Medications and solutions
Unitropic 1% gtt.	UNIMED PHARMA spol. s r.o., Bratislava, Slovak republic	tropicamidum 10 mg/ml	eye drops
Diprophos	Merck Sharp & Dohme B.V., Haarlem, Netherlands	betamethasonum 7 mg/ml	1ml
Alcon BSS Irrigation Solution	Alcon, Geneva, Switzerland	balance salt solution (BSS)	500ml
Betaisodona	Mundipharma, Cambridge, United Kingdom	povidon-Iodine 1g/10ml	30ml
Depo-medrol 120mg	Pfizer, New Yourk, USA	methylprednisolon	5ml/200mg
Shotapen	Virbac Carros Cedex, France	benzylpenicillin, dihydrostreptomycin	250ml
Flunixin a.u.v.	Norbrook, Newry, Northern Ireland	flunixinum 50,0 mg	250ml
Tramal 100MG/2ML	Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschland	tramadol	2ml
Zoletil 100	Virbac Carros Cedex, France	tiletamine, zolazepam	100mg
Narkeran 10	Vetoquinol, Magny-Vernois, France	ketamin	2ml
Rometar 20mg/ml	Spofa pharmaceutica, Prague, Czech republic	xylazinum	20mg
Braunol 75mg/g	B.Braun medical, Prague, Czech republic	povidone iodine	75mg/g
Propofol 1% MCT/LCT	Fresenius Kabi, Bad Homburg, Deutschland	propofol	10mg/1ml
Isoflurane 100% Inhalation vapour, liquid	Piramal Critical Care Limited, West Drayton, United Kingdom	isoflurane	100%
Benoxi gtt.  4mg/1ml	Unimed pharma, Bratislava, Slovakia	oxybuprakaine	10ml
Neosynephrin POS 10% gtt.	Ursapharm , Saarbrücken, Deutschland	fenylefrin chloride	10ml
Ophthalmo-framykoin 1X5GM	Zentiva a.s.,  Prague, Czech republic	bacitracin zinc/hydrocortisone acetate/hydrocortisoneacetate/neomycin sulfate	5mg
Floxal ung.	Dr. Gerhard Mann Chem.-Pharm. Fabrik, Berlin, Germany	ofloxacin	0.30%
Eficur inj.	Hipra, Amer, Spain	ceftiofurum hydrochloridum	50mg / 1ml
Draxxin	Zoetis Inc., New Jersey, USA	tulathromycinum	100mg / 1ml
Tramal	Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschland	tramadoli hydrochloridum	100mg / 2ml
Xylapan	Vetoquinol, Magny-Vernois, France	xylazinum	0.4 mg/kg
Proparacaine hydrochlorid ophthalmic solution 0,5%	Bausch&Lomb Incorporated Tampa, FL, USA	Proparacaine hydrochlorid	0.50%
Prograf	Astellas Pharma, Deerfield, Illinois, USA	Tacrolimus powder	1mg
Cell carrier, cultivated cells cultures, and implantation injector
Falcon Cell Culture Inserts	Corning Inc., Kenneburg, ME, USA	353103
TrypLE Express Enzyme (1X)	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	12604021
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	11320033
Biolaminin 521 LN (LN521)	BioLamina, Sundbyberg, Sweden	LN521-02
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	35050061
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	J66742.0B
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich, San Luis, Mi, USA	P4333
CRALBP	Novus Biologicals, Abingdon, UK	NB100-74392
Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific, Germany	21202