Subretinal implantation av RPE på en bärare i minigrisar: riktlinjer för preoperativa preparat, kirurgiska tekniker och postoperativ vård

Summary

Den subretinala implantationen av retinalt pigmenterat epitel (RPE) är en av de mest lovande metoderna för behandling av degenerativa näthinnesjukdomar. Utförandet av prekliniska studier på storögda djurmodeller är dock fortfarande utmanande. Denna rapport presenterar riktlinjer för subretinal transplantation av RPE på en cellbärare till minigrisar.

Abstract

Degenerativa störningar i näthinnan (inklusive åldersrelaterad makuladegeneration), som huvudsakligen har sitt ursprung vid eller inom det retinala pigmenterade epitelskiktet (RPE), leder till en progressiv disorganisering av näthinnans anatomi och försämringen av visuell funktion. Substitutionen av skadade RPE-celler (RPE) med in vitro-odlade RPE-celler med hjälp av en subretinal cellbärare har visat potential för att återupprätta den anatomiska strukturen hos de yttre näthinnelagren och studeras därför ytterligare. Här presenterar vi principerna för en kirurgisk teknik som möjliggör effektiv subretinal transplantation av en cellbärare med odlade RPE till minigrisar. Operationerna utfördes under generell anestesi och inkluderade en standard linssparande tre-port pars plana vitrektomi (PPV), subretinal applicering av en balanserad saltlösning (BSS), en 2,7 mm retinotomi, implantation av en nanofibrös cellbärare i subretinalutrymmet genom ytterligare 3,0 mm sklerotomi, vätske-luftutbyte (FAX), silikonoljetamponad och stängning av alla sklerotomier. Detta kirurgiska tillvägagångssätt användes i 29 operationer (18 djur) under de senaste 8 åren med en framgångsgrad på 93,1%. Anatomisk verifiering av den kirurgiska placeringen utfördes med hjälp av in vivo fundus-avbildning (fundusfotografering och optisk koherenstomografi). De rekommenderade kirurgiska stegen för subretinal implantation av RPE på en bärare i minigrisögon kan användas i framtida prekliniska studier med storögda djurmodeller.

Introduction

Åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) anses vara den främsta orsaken till central synförlust i utvecklade länder och är ett av många tillstånd relaterade till retinal pigmenterat epitel (RPE) dysfunktion ^1,2. RPE finns på det basalt belägna Bruchs membran (BM) och ger det nödvändiga underhållet för fotoreceptorerna. Den progressiva degenerationen av RPE-skiktet är ett kännetecken för den tidiga atrofiska formen av AMD, och den åtföljer också utvecklingen av den sena exsudativa formen av AMD också. Trots många framsteg inom retinal sjukdomsbehandling är utvecklingen av en effektiv behandlingsmodalitet fortfarande utmanande³. En av de lovande metoderna är RPE-ersättning med hjälp av ett in vitro-odlat RPE-lager. Denna behandling är förknippad med framsteg inom stamcellsforskning med humant embryonalt stamcellshärlett RPE (hESC-RPE) och inducerat pluripotent stamcellshärlett RPE (iPSC-RPE)3,4,5,6,7. Under de senaste åren har många forskargrupper fokuserat på att utveckla olika metoder för RPE-ersättning med det ursprungligen accepterade proof-of-concept 8,9,10,11,12,13,14,15. RPE-cellerna (RPE) levereras vanligtvis in i subretinalutrymmet i form av en cellsuspension, ett självbärande cellark eller ett cellmonolager som stöds av en artificiell bärare 3,16,17,18,19,20,21. Injektion av en cellsuspension är den enklaste metoden, men BM: s komprometterade tillstånd kan ofta förhindra fästning av de transplanterade cellerna. Detta kan resultera i felaktig apicobasal orientering av RPE och misslyckande med att bilda ett monolager^22,23. Den största fördelen med de andra två metoderna (dvs ett självbärande cellark och ett cellmonolager som stöds av ett konstgjort substrat) är att cellerna redan är i ett differentierat monolagertillstånd när de implanteras direkt i subretinalutrymmet²⁴.

Många kirurgiska tekniker som beskriver leverans av cellbärare till subretinalutrymmet har publicerats de senaste åren 8,9,10,11,12,13,14,15. Dessa studier beskrev användningen av storögda djurmodeller, typerna av cellulära bärare, användningen av transplanterade cellulära kulturer, implantationsinstrumenten samt kirurgiska tekniker, och författarna fokuserade huvudsakligen på resultaten av subretinal implantation. År 2015 rapporterade Popelka et al. användningen av ett ramstött ultratunt elektrospunnet polymermembran för transplantation av RPE i svinkadaverögon⁸. Den kirurgiska tekniken som beskrivs här med subretinal implantation av cellbäraren möjliggjorde relativt exakt hantering av bäraren och enkel positionering av ställningen i subretinalutrymmet. Kozak et al. bedömde genomförbarheten av leveranstekniken hos en bärare med en ungefärlig storlek på 2 mm x 5 mm i svinögon⁹. Den unika utformningen av cellbäraren möjliggjorde korrekt placering, vilket förhindrade att det cellulära monolagret viks och skrynklas⁶. Al-Nawaiseh et al. presenterade först detaljerade steg-för-steg-riktlinjer för subretinal ställningsimplantation hos kaniner²⁵. Stanzel et al. publicerade sedan ett liknande protokoll 2019 för transplantation hos små gnagare, kaniner, grisar och icke-mänskliga primater²⁶. Som tidigare publicerats resulterade transplantationen av ett differentierat och polariserat RPE-monolager på en fast bärare i förbättrad överlevnad och bättre integration av transplantatet jämfört med andra leveranstekniker (kompletterande fil 1)²⁷.

Syftet med alla prekliniska djurstudier som utförs in vivo är att avslöja de olika aspekterna av kirurgisk transvitreal subretinal implantation av en cellbärare med fokus på procedursäkerheten, överlevnaden av de transplanterade cellerna, vävnadssvaret på de subretinala manövrarna och de kort- och långsiktiga postoperativa resultaten. Användningen av svinögon som en storögd djurmodell har rapporterats vara relevant när det gäller omfattningen av de erhållna uppgifterna, vilket kan vara användbart och potentiellt tillämpligt på människor^10,11,14. Vår studie rapporterar den kirurgiska tekniken som används för in vivo subretinal implantation av en cellbärare i en storögd djurmodell. Vi presenterar en detaljerad beskrivning av de preoperativa preparaten, den kirurgiska tekniken för implantation av subretinal cellbärare och den postoperativa vården av minigrisögonen baserat på vår erfarenhet under de senaste 8 åren. Vi beskriver de grundläggande kirurgiska principer som kan användas för in vivo experimentella studier som involverar implantation av olika typer av celler och cellbärare.

Stor djurmodell
Den experimentella besättningen av Liběchov minigrisar grundades genom att importera fem djur från Hormel-stammen från USA 1967. Dessa djur korsades för svinblodgruppsstudier med flera andra raser eller stammar: Landrace, Large White, Cornwall, vietnamesiska grisar och miniatyrgrisar av Göttingen-ursprung^28,29. Vid 5 månaders ålder och cirka 20 kg kroppsvikt (BW) når minigrisarna sexuell mognad. Överlevnaden av föräldrarnas minigrisraser (Hormel och Göttingen) rapporteras vara 12-20 år. Den subretinala implantationen av cellbäraren riktar sig mot den centrala delen av näthinnan. Minisvinens näthinna saknar en makula och fovea. Det har emellertid regioner med högkonade konfotoreceptorer som kallas området centralis och visuella streck^30,31. Dessa regioner ansvarar för högsta synskärpa.

Operationerna utfördes av fyra erfarna vitreoretinala kirurger med hjälp av en erfaren kirurgisk anläggningsassistent (TA). Före in vivo-experimenten utbildades kirurgerna och fick särskild kunskap om minipigögonanatomi, såsom avseende det lägre förhållandet mellan lins och glaskroppsvolym, den kortare axiella längden (15-19 mm), frånvaron av Bowmans membran i hornhinnan, den mindre glaskroppen (2,8-3,2 ml), frånvaron av makula och fovea, frånvaron av ringformen av Zinn och den optiska skivans diameter (vertikal/horisontell: 1,5 mm/2,1 mm). I samtliga fall utfördes operationen under generell anestesi i ett speciellt organiserat operationsrum med genomförande av standard aseptiska och antiseptiska åtgärder.

Protocol

Denna studie följer principerna i riktlinjerna i Helsingforsdeklarationen och etiska principer för medicinsk forskning som involverar människor. Alla försök utfördes enligt riktlinjerna för vård och användning av försöksdjur och enligt Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) för användning av djur i oftalmisk och visuell forskning. Studieprotokollet godkändes av Resort Professional Commission of the CAS för godkännande av projekt för djurförsök vid Institutet för djurfysiologi och genetik vid den tjeckiska vetenskapsakademin (Liběchov, Tjeckien) (godkänt protokoll nr 60/2016 och nr 64/2019).

1. Överväganden vid subretinal transplantation av celler på en bärare till minigrisar

1. Val av djur
   1. Skaffa och använd Liběchov minigrisar som är 12-36 månader gamla, antingen kön, och cirka 40-80 kg kroppsvikt (BW).
   2. Håll minigrisarna inomhus i ett luftkonditionerat djurhus med temperaturer mellan 18-22 °C, exponering för en konstgjord 13 h / 11 h ljus / mörk cykel, standardiserade individuella pennor, fri tillgång till vatten och två gånger dagligen utfodring.
2. Förberedelse före operationen
   1. Kontrollera om ögat är kirurgiskt orienterat och rita fundussystemen. För att göra det, dela schematiskt näthinnan hos minigrisarna på fundusritningen med en penna med en vertikal linje i de temporala (från optisk skiva mot örat), nasala (från optisk skiva mot grisens nos) och centrala (mellan de stora retinala kärlen på nässidan) regioner (figur 1A, B).
   2. Välj endast friska djur utan beteendemässig och neurologisk patologi och med normal kvalitet på hud, kroppsöppningar, avföring och matkonsumtion. Låt en skicklig veterinär utföra den kliniska observationen och välja djuren.
   3. Injicera intramuskulärt 3 mg/kg kroppsvikt ceftiofurhydroklorid (1 ml/kg) på operationsdagen.
3. Preoperativ immunsuppression
   1. Bered takrolimuseluerande polymermikrosfärer enligt beskrivningen i Wang et al. och Sevc et al. ^32,33 med modifiering.
   2. Se till att koncentrationen av takrolimus i polymermikrosfärerna är 51,3 mg/g enligt HPLC (Table of Materials).
   3. Utför en subkutan injektion av takrolimusladdade polymermikrosfärer i en dos på 0,25 mg/kg kroppsvikt 6 dagar före ögonoperationen för att förhindra avstötning av celltransplantat. Detta görs för att säkerställa överlevnaden av de mänskliga RPE-donatorcellerna under xenogen transplantation i minigrisögonen.
   4. Injicera djuren intramuskulärt på operationsdagen med 80 mg depo-medrol och bensylpenicillin vid 1 ml/10 kg beroende på kroppsvikt.
4. Anestesi
   1. Inducera generell anestesi med en intramuskulär injektion av en blandning av tiletamin (2 mg/kg), zolazepam (2 mg/kg), ketamin (2 mg/kg) och xylazin (0,4 mg/kg)-TKX^34,35 före operationen. Kontrollera anestesidjupet genom ett tillstånd av medvetslöshet och genom att kontrollera pedalreflexen (en nypa av bakbenets interdigitala hud), hornhinnereflexen (en liten beröring av hornhinnan), pupillreflexen (reaktion på ljuset) och palpebralreflexen (en beröring av ögonlocket). Se till att djuret inte blinkar. Bekräfta hjärtat och andningsfrekvensens regelbundenhet.
   2. Efter induktion av anestesi, transportera det sederade djuret till operationssalen på en lyftvagn (figur 2A).
   3. Placera djuret på operationsbordet på vänster sida för att möjliggöra operation på höger öga (figur 2B).
   4. Utför justeringen av djurets huvud med hjälp av styrofoamkuddar för att uppnå den lämpligaste positionen för den centrala näthinnan för implantation (dvs. horisontellt och parallellt med golvet) (figur 2C).
   5. Placera ögondroppar av 0,5% proparakainhydroklorid oftalmisk lösning i konjunktivalsäcken tre gånger 1 min mellanrum för att inducera lokalbedövning.
   6. Sätt in en venkanyl och intubera djuret med ett endotrakealt rör för inhalationsunderhåll av anestesi (1,5% isofluran) med hjälp av en anestesimaskin utrustad med en patientmonitor (figur 2A, B).
   7. Administrera en intramuskulär injektion av 1 ml Eficur per 16 kg kroppsvikt och 20 mg Depo-Medrol 1 cirka 15 minuter före ögonoperationens början (materialtabell).
   8. Bibehålla den fysiologiska kroppstemperaturen genom att täcka djuret med isotermisk folie och utföra operationen enligt beskrivningen i avsnitt 3.
   9. Under operationen, övervaka djurets temperatur tillsammans med hjärtfrekvensen och blodets syremättnad med hjälp av en öronklämma och patientmonitor. Undvik att sänka kroppstemperaturen under 38 °C under procedurerna, vilket anses vara en säker gräns³⁶. Behåll syremättnaden (>96%) och pulsfrekvensen (70-90 slag per minut) under hela experimentet.
   10. När operationen är klar, stäng av flödet av isofluran och extubera djuret.
   11. Efter spontan andning och uppvaknande, överför djuren till sina pennor.
5. Inställning av operationssal
   1. Ordna operationssalen enligt operationens behov på ögonen på den stora ögondjurmodellen (figur 3A, B). Justera höjden på kirurgens stolar, liksom mikroskopets höjd, för att uppnå en bekväm position för kirurgerna med avseende på positionen för grisens snut.

Figur 1: Schematisk ritning av näthinnans zoner hos minigrisar. A) Schematisk ritning av näthinnans zoner i förhållande till minigrisens huvud. den gula ellipsen visar det önskade området för subretinal implantation, T hänvisar till det temporala retinalområdet och N hänvisar till näsnäthinnan. (B) Exempel på fundus-schemat efter subretinal implantation av cellbäraren (gul) genom retinotomi (röd). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Transport och placering av djuret . (A) Transport av det sederade djuret till operationssalen. b) Djurets placering under intubationen. (C) Justering av djurets huvud för optimal åtkomst till den centrala näthinnan under operationen (röd pil). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: Standardinställningen för operationssalen. (A) Schematisk bild av kirurgernas position (S = kirurg, A = assistent) i förhållande till operationsbordets position med minigrisen, operationsmikroskopet (OM), vitrektomimaskinen (VM), instrumentbordet (IT) och anestesiologimaskinen (AM). Det finns två möjliga positioner för vitrektomimaskinen (gul och grå). (B) Verklig miljö i operationssalen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

2. Cellbärare, odlade cellkulturer och implantationsinjektor

1. Cell bärare
   1. Skär den 30 μm breda ovala ramen med yttermåtten 1,7 mm x 4,8 mm, utrustad med triangulära utsprång asymmetriskt placerade på ramen (figur 4A), från en biaxiellt orienterad 36 μm tjock polyetentereftalatfolie (PET) med en femtosekundlaser.
   2. Bered poly(L-laktid-co-DL-laktid) (LLA/DLLA 90/10, MW 868, 270 g/mol) polymerlösning i pyridin i en koncentration av 11 viktprocent med tillsats av 2,2 μl myrsyra per 1 g lösning.
   3. Förbered det nanofibrösa membranet med en inbäddad stödram (figur 4B) genom elektrospinning av polymerlösningen i tre steg⁸: (1) deponera det första lagret av nanofibrer på ett kiselsubstrat, (2) placera ramen på skiktet och (3) deponera det andra lagret av nanofibrer.
      OBS: Deponera varje lager i 7 minuter för att nå en total membrantjocklek på 3,7 μm. Använd följande parametrar för att erhålla ett membran bestående av 380 nm tjocka fibrer och med en genomsnittlig porstorlek på 0,4 μm och en porositet på cirka 70%³⁷: en 20 G stålnål, en spänning på 7,1 kV, ett mellanrum på 10 cm, en flödeshastighet på 250 μl / min och en temperatur på 25,0 ° C ± 0,5 ° C.
   4. Ta försiktigt bort membranet med den inbäddade ramen från kiselsubstratet och fixera det på kroppen av en kommersiell 12-brunnscellkulturinsats utan det ursprungliga membranet för att underlätta sådd och tillväxt av celler.
   5. Behandla det nanofibrösa membranet före cellsådd i luftplasma i 30 s med en effekt av 70 W i en plasmarenare.
2. Cellkulturer som används för odling på cellbäraren
   OBS: Följande cellbärare kan användas: 1) nanofibrösa cellbärare utan några celler; 2) nanofibrösa cellbärare med primära humana RPE (hRPE), 3) nanofibrösa cellbärare med humana iPSC-härledda RPE-celler.
   1. Odling av primära hRPEs
   2. Isolera primära hRPE-celler från mänskliga donatorögon enligt en tidigare rapporterad teknik³⁸.
   3. Hämta cellerna genom enzymatisk behandling av näthinnan i 30 minuter. Odla sedan de primära hRPE-cellerna (passage 0) i upp till 2 veckor i DMEM / F12 kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS).
   4. När cellkulturerna når sammanflöde, byt medium till 1% FBS och kultur i ytterligare 30 dagar.
   5. Frö de primära hRPE: erna på transbrunnsplattor och på en lamininbelagd nanofibrös cellbärare med en densitet av 2,000 celler / mm². Efter ytterligare 30 dagars inkubation i 1% FBS, använd cellbärarna med primära hRPE för subretinal implantation i minigrisar.
3. Mänskliga iPSC-härledda RPE:er
   1. Använd hiPSC härledda från MERTK-associerade retinitpigmentosa patienthärledda fibroblaster 39 som är genkorrigerade i två alleler med hjälp av CRISPR/^{Cas9-systemet} (RP1-FiPS4F1-GC2)⁴⁰, samt hiPSC härledda från fibroblaster hos en frisk försöksperson (Ctrl2-FiPS5F2)⁴¹ som används som kontroll.
   2. Generera och därefter differentiera båda hiPSCs-cellinjerna mot RPE-celler (hiPSC-RPE) som rapporterats tidigare⁴².
   3. Platta hiPSC-RPE vid 200 000 celler/^cm2 på lamininbelagda cellodlingsinsatser med nanofibrösa membran av poly(L-laktid-co-DL-laktid) med ovala implantationsramar i RPE-medium innehållande knockout DMEM, 20% knockoutserum, 0,1 mM icke-essentiella aminosyror, 0,23 mM β-merkaptoetanol, 100 E/ml penicillin, 0,1 mg/ml streptomycin och 10 mM nikotinamid.
   4. Byt medium varannan dag och odla hiPSC-RPE i 2 månader före implantation för att uppmuntra polariserad tillväxt.
4. Injektor för implantation
   1. Förbered en plastkapillär med ett rektangulärt tvärsnitt på 2,8 mm x 0,8 mm genom formblåsning från ett plaströr med OD 1,75 mm / ID 1,10 mm.
   2. Skär ett lastfönster på 4 mm x 2,2 mm i plastkapillären 6 mm från änden.
   3. Montera injektorn från plastkapillären, ett silikonhandtag, en stålbladkolv och en kolv (figur 5A).
   4. Ladda bäraren i injektorn genom ett laddningsfönster och mata senare ut den i det subretinala utrymmet genom ett tryck på kolven, enligt beskrivningen i steg 3.5.2 (figur 5B).
5. Beredning av den nanofibrösa bäraren och laddning av injektorn
   1. Fyll en liten petriskål av plast med 2 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Ta ut en insats med det förberedda cellskiktet, placera det på en halvmjuk polystyrenskål och centrera den under ett ljusmikroskop. Använd en specialmodifierad stans för att klippa ut bäraren längs den ovala ramen med hjälp av ett mikroskop. Bärarens mått ska vara 2 mm x 5 mm.
   2. Använd en skräddarsydd injektor med platt transparent slang för lastning av bäraren; 6 mm från kapillärens distala ände finns ett fönster för lastning av bäraren. Fyll injektorns fönster med PBS.
   3. Släpp provet från botten av skålen med hjälp av pincetten, lyft det från vätskan och transportera det till injektorns fönster medan du först kontrollerar sidoorienteringsmärkena på ramen för att upptäcka bärarens ovansida med vidhäftande celler. En oval ram underlättar manipulation med bäraren.
   4. Använd en tandsond (ett tandinstrument i rostfritt stål med en skarp ände) och placera bäraren i injektorns fönster. Använd kolven för att trycka in bäraren i den stängda och säkra övre delen av injektorn. Förbered sedan bäraren för operation.
   5. Kontrollera bärarens sidoorientering vid varje steg. Lossa den nanofibrösa bäraren från injektorn genom att trycka på metallkolven.

Figur 4: Bärare av nanofibrös styrka med en inbäddad stödjande PET-ram. (A) Tre synliga märken på ramen gör det möjligt att styra bärarens sidoorientering (vita pilar). (B) Utvidgningsvy av PET-ramfragmentet inbäddat i cellbärarens nanofibrösa membran (vita pilar). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5: Insprutningsinjektor . a) Injektorns delar. (B) Nanofibrös cellbärare med inbäddad stödjande PET-ram laddad till implantationsinjektorns rektangulära kapillär. Klicka här för att se en större version av denna figur.

3. Kirurgiskt ingrepp

1. Kirurgisk utrustning
   1. Använd följande kirurgiska utrustning: ett oftalmiskt kirurgiskt mikroskop, ett operativsystem för operationer på de främre och bakre ögonsegmenten, ett kontaktfritt vitreoretinalt kirurgiskt system, en laserfotokoagulationsanordning och en digitalkamera.
      De standardparametrar som används vid vitrektomi, exo- och endokauteri samt laserfotokoagulationsutrustning visas i tabell 1.
2. Kirurgiska instrument
   1. Sterilisera de återanvändbara kirurgiska instrumenten med en mobil autoklavångsterilisator eller liknande enligt ett standardprotokoll. De kirurgiska engångsinstrument och material som krävs under operationen listas i materialtabellen.
3. Förberedelse för de kirurgiska stegen
   1. Efter bedövning av djuret enligt beskrivningen i steg 1.4.1, applicera 1% tropicamidlösning ögondroppar och 10% fenylefrinhydrokloridlösning i konjunktivalsäcken 15 minuter före proceduren för att provocera läkemedelsinducerad mydriasis.
   2. Närma dig operationsbordet med kirurgen i det övre läget och assistenten i sidoläget (figur 3).
   3. Raka området runt ögat med en rakhyvel för engångsbruk och ta bort grov smuts.
   4. Desinficera konjunktivalsäcken med 5% povidon-jodlösning i 5 minuter.
   5. Desinficera periorbitalområdet med bomullspinne genom att skrubba från ögonlocken till periferin. Upprepa processen tre gånger med en 10% povidon-jodlösning och låt stå i 5 minuter.
   6. Täck operationsfältet med ögat i mitten med ett vanligt sterilt oftalmiskt draperi med klibbig transparent folie. Flytta ögonfransarna bort från ögongloben. Undvik att skära ögonfransarna för att minska risken för postoperativ endoftalmit.
   7. Sätt i lockspekulum (Liberman-typ eller Cook ögonspekulum). Eventuellt fixera det nictiterande membranet på huden med 8-0 polyglaktin sutur.
   8. Öppna bindhinnan på nässidan 2 mm till 3 mm från limbus för att exponera sclera för sklerotomier med kirurgiska pincett och Westcott konjunktival sax.
   9. Sätt in de treventilerade 25 G-trokarkerna 2,5-3 mm från limbus i pars plana-området (placera dem klockan 7, klockan 10 och klockan 11). Använd roterande rörelser under insättningen på ett något snett sätt (100°-110°) mot den bakre näthinnan och håll trokaren med pincetten (figur 6).
   10. Håll hornhinnan våt eller belägg den med metylcellulosa under hela operationen för att förhindra osmotiskt hornhinneödem.
4. Pars plana vitrektomi (PPV)
   1. Ta bort den mellersta delen av glaskroppen med standard tre-port pars plana vitrektomi-metoden. Ta försiktigt bort glaskroppen bakom linsen i området för den framtida stora sklerotomin.
   2. Använd en intravitreal 2-4 mg triamcinolonacetonid (TA) injektion (50-100 μL) för att fläcka den bakre glaskroppen, som vanligtvis förblir vidhäftande till näthinnan, för att utföra en kontrollerad bakre glaskroppsavlossning.
   3. Därefter utför långsamt en subretinal injektion av 0,05-0,1 ml BSS med en 41 G kanyl mer centralt, vilket undviker bildandet av en bleb mot periferin.
   4. Minska inställningarna för intraokulärt tryck med bevattningssystemet ner till 15 mmHg under subretinal injektion för att förhindra en övergående retinal vaskulär ocklusion.
   5. Utför en linjär stor endodiatermi i näthinnan med en 27 G endodiatermi sond 3 mm nära näsbotten.
   6. Gör sedan en 3 mm stor retinotomi med ett 25 G MVR-blad eller vertikal sax med en förhöjd intraokulär tryckinställning (IOP) av bevattningssystemet upp till 60 mmHg i 3 minuter till 5 minuter. Se till att det inte finns någon blödning från retinotomi och minska sedan IOP till 25 mmHg.
   7. Utför en exodiatermi av episklerala kärl mellan de två nästrokar 2,5-3 mm från limbus med en 27 G endodiatermi sond genom att applicera en mild beröring på ytan av sclera.
   8. Kontrollera vätskenivån i infusionsflaskan innan du förstorar sklerotomin, eftersom vätskeförbrukningen är tillfälligt hög efter sklerotomiförstoring.
   9. Gör en 3,0 mm stor sklerotomi, 3 mm från limbus, med en 2,75 mm phacokniv.
   10. Var uppmärksam på eventuell blödning från sklerala kärl och ciliary kropp inuti den stora sklerotomin. Vid blödning, använd en 27 G endodiatermisond för att koagulera de skadade kärlen. Förstora sklerotomin till 3,0 mm med en satinkniv för att rymma injektorns spets (0,8 mm x 2,8 mm).
   11. Ta bort den prolapsed glaskroppen på platsen för den stora sklerotomin med en vitrector. Håll infusionen av BSS i nivå med 25-30 mmHg med vitrektomisystemet för att undvika klotkollaps.
5. Implantation av cellbäraren
   1. Sätt försiktigt in injektorn med den dominerande handen i glaskroppen genom den stora sklerotomin. Vid motstånd, förstora storleken på sklerotomin.
   2. Implantera cellbäraren genom retinotomi i subretinalutrymmet. Använd vid behov en bimanuell teknik med ytterligare sklerotomi och ljuskrona för att förbättra kontrollen av implantationen.
   3. Dra ut injektorn från ögat och stäng den stora sklerotomin med en 8-0 polyglaktinsutur för att undvika komplikationer i samband med intraokulär hypotoni.
   4. Utför ett fullständigt vätske-luftutbyte (FAX) och dränering av subretinalvätskan med en silikonspetsad kanyl.
   5. Därefter injiceras silikonolja (1 000 cSt) i glaskroppen med hjälp av vitrektomisystemet och slangsystemet för injektion av silikonolja tills IOP är normalt.
6. Intraoperativ avbildning och dokumentation
   1. Utför en videoinspelning under hela operationen med fotodokumentation av de viktigaste stegen för implantation med hjälp av ett videoinspelningssystem.
   2. Slutför fundusritningen genom att dokumentera platsen för sklerotomier, retinotomi, subretinalt implantat och eventuella komplikationer som inträffade med hjälp av fundusritningsscheman.
7. Steg efter operationen
   1. I slutet av operationen, ta bort trokarerna och stäng de tre sklerotomierna och konjunktiva med 8-0 polyglaktin suturer.
   2. Skölj konjunktivalsäcken med 5% povidon-jodlösning.
   3. Utför en 0,3 ml subkonjunktival injektion av 20 mg gentamicin, 2 mg dexametason och 2% xylocain.
   4. Kontrollera fundus och linsens tillstånd med hjälp av en mikroskopisk vy.
   5. Ta bort suturen (suturerna) från det nictiterande membranet med kirurgiska pincett och Westcott-konjunktivalsax (valfritt).
   6. Applicera neomycinsalva eller ofloxacin oftalmisk salva i konjunktivalsäcken.

Figur 6: Insättning av trokar i ögat på en minigris . (A) Schematisk avbildning av trokar, som sätts in vinkelrätt i sclera mot mitten av glaskroppen i det mänskliga ögat (grå färg) och på ett snett sätt mot den bakre näthinnan i minipigögat (blå färg) för att undvika skador på linsen. Minigrisens lins (blåfärgad) är större än hos människor och i förhållande till glaskroppsstorleken. (B) Intraoperativ vy av de införda trokar i en PPV med tre portar. Hornhinnan är täckt med metylcellulosa för att förhindra torkning och svullnad. Klicka här för att se en större version av denna figur.

4. Postoperativ vård

1. Applicera aktuell bacitracin zink / hydrokortisonacetat / neomycinsulfat eller 0,3% ofloxacin i konjunktivalsäcken hos djuren fem gånger per dag.
2. Kontrollera postoperativt följande ögonparametrar: turgor i ögonmjukvävnaderna med palpation, inflammatorisk reaktion på ögonytan och kisning som en skyddande reaktion av ögonlocken med hjälp av en handhållen slitslampa eller indirekt oftalmoskop.
3. För systemisk postoperativ vård, använd följande antibiotika:
   1. Injicera intramuskulärt ceftiofurhydroklorid i dosen 3 mg/kg kroppsvikt (1 ml/kg) på den andra och tredje stabila dagen.
   2. Injicera tulatromycin (1 ml/40 kg kroppsvikt) efter 72 timmar efter operationen för förebyggande av sekundär bakteriell infektion.
4. Utför en intramuskulär injektion av flunixin (2 ml / 45 kg levande vikt) och tramadolhydroklorid (100 mg) var 24: e timme i 3 dagar efter operationen för att förhindra smärta.
5. Förvara minigrisarna i en specialiserad luftkonditionerad anläggning med ett temperaturintervall på 18-22 °C och en konstgjord 13 h/11 h ljus/mörk regim.
6. Se till att de har fri tillgång till vatten och standardmatning (två gånger per dag).

5. Postoperativa förfaranden

1. Postoperativa oftalmiska undersökningar
   1. Under den postoperativa perioden, inspektera ögonen med ett indirekt oftalmoskop för förekomst av inflammation (dvs rodnad, vävnadsvullnad eller slemstoppning i konjunktivalsäcken). Mät det intraokulära trycket i det opererade ögat med palpationsmetoden.
2. Postoperativ avbildning
   1. Inducera sedering i minigrisen genom intramuskulär injektion av en TKX-blandning före fundusfotografering och OCT-undersökning. Instill 1% tropikamid och 10% fenylefrinhydroklorid ögondroppar i konjunktivalsäcken hos minigrisen för att inducera mydriasis.
   2. Använd ett lockspekulum för att hålla öppna ögon. För att fukta ögonytan och för att få en tydlig OCT-bild, tvätta djurets hornhinna med saltlösning (0,9% NaCl) var 30-60 s.
   3. Placera minigrisen på operationsbordet på samma sätt som under operationen (figur 2B, C, figur 3A). Huvudkravet är att placera huvudet på sidan och vinkelrätt mot skanningsstycket på OCT-enheten. Använd styrofoamkuddar under djurets nos för att stabilisera huvudet, vilket ger ögonytan i ett horisontellt läge.
   4. Samla in fundusbilder i färg med en icke-mydriatisk funduskamera i färg, eftersom detta gör det möjligt att dokumentera det främre segmentet, näthinnan och optisk skiva. Ta dessutom en rödfri bild av näthinnan med den icke-mydriatiska funduskameran.
   5. Utföra optisk koherenstomografiavbildning med hjälp av spektraldomänens OCT-system. Under OCT- eller fundusavbildning, luta minigrisens huvud manuellt mot OCT-linserna eller funduskameralinserna för att optimera utsikten över den bakre näthinnan och implantationsområdet (figur 2C). För optimal avbildning av den implanterade bäraren på fundus, applicera OCT-enhetens infraröda reflektansljus för att fokusera på implantatet (figur 2C). Använd OCT-korslinje- och näthinnekartskanningslägena.
   6. Applicera ofloxacin oftalmisk salva vid slutet av undersökningen under locket på djurets öga.
   7. Flytta minigrisen till inomhusanläggningen och observera dess allmänna tillstånd till slutet av sederingen (cirka 2 timmar till 5 timmar).

6. Enukleation av ögat post mortem efter eutanasi

1. Lugna minisvinen med en intramuskulär injektion av TKX-blandningen följt av en intravenös (genom en 22 G öronkanyl) bolusapplicering av 1 % propofol (20 ml/djur) följt av exsanguinering. Använd inte allmänna fixeringsmedel.
2. Offra djuren genom exsanguination under djup generell anestesi 7 dagar, 14 dagar, 28 dagar och 42 dagar efter celltransplantatimplantation.
3. Använd pincett och sax för att ta bort de övre och nedre ögonlocken. Ta bort det tredje ögonlocket och skär genom bindhinnan. Skär ögonmusklerna och synnerven.
4. Enucleate ögonen post mortem med kirurgisk sax och kirurgiska pincett. Se till att proceduren utförs av en erfaren person.

Discussion

Subretinal implantation av RPE-celler med olika ursprung är en mycket lovande trend inom ögonforskning för behandling av retinala degenerativa störningar, såsom AMD 3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,25 . Huvudidén med detta tillvägagångssätt är att ersätta de skadade RPE: erna med friska RPE odlade ex vivo (kompletterande fil 1) 44,45,46,47,48. Användningen av cellbärare för att transplantera de odlade RPE-cellerna representerar det mest rimliga tillvägagångssättet, eftersom de porösa membranen håller det polariserade RPE-cellskiktet i rätt orientering med avseende på det fotosensoriska skiktet.

Optimal djurmodell
Ett kritiskt steg i utvecklingen av sådana behandlingsmetoder är användningen av den optimala djurmodellen⁴⁹. Tidigare har små och stora djurmodeller använts, inklusive kaniner, hundar, grisar och icke-mänskliga primater 8,9,10,11,12,13,14,15,27,29. I denna uppsats föreslår vi användning av Liběchov minipig-modellen och beskriver de preoperativa, kirurgiska och postoperativa stegen som möjliggör robusta transplantationseffektiviteter. Minigrisen Liběchov föddes ursprungligen för cirka 20 år sedan och har ofta använts inom biomedicinsk forskning inom neurodegenerativa sjukdomar, såsom Parkinsons och Huntingtons sjukdom^29,50. Eftersom grisen har en relativt stor hjärna med en blodtillförsel och immunologiskt svar som liknar dem hos människor, har den använts som djurmodell för allogen transplantationsexperiment samt^51,52,53,54. Även om minigrisens näthinna inte har en människoliknande makula och fovea, innehåller den området centralis och visuella streck, som är regioner i näthinnan med en hög koncentration av konfotoreceptorer³⁰. Den liknande storleken på det mänskliga ögat, närvaron av en konberikad central näthinna, det väl beskrivna immunsystemet och förekomsten av metoder för att bedöma morfologi och funktion efter operationen är viktiga argument för användningen av denna stora djurmodell i den presenterade studien.

Kirurgiskt ingrepp
Så vitt vi vet finns det inga standardiserade och allmänt accepterade kirurgiska tekniker för vitreoretinal transplantation av RPE-celler på bärare. En av de viktigaste frågorna med cellersättningsterapi är den utmanande kirurgiska tekniken som har risk för intraoperativa och postoperativa komplikationer kopplade till näthinneavlossning, hypotoni, episkleral, koroidal och / eller retinal blödning och hög intraokulär turbulens, vilket kan leda till ställningsskador. Postoperativt finns det risk för proliferativ vitreoretinopati, endoftalmit, hypotoni, näthinneavlossning och kataraktbildning 4,10,13,14,15.

De första studierna på tillvägagångssätt med cellbärare utfördes på chinchilla bastard kaniner^13,16,25. Även om dessa djur representerar en smådjursmodell var resultaten med fokus på de tekniska aspekterna av operationen avgörande för utvecklingen av procedurerna i stora djurmodeller och sammanfattas därför nedan.

En skräddarsydd 23 G infusionskanyl användes ursprungligen med två sidoportar för att omdirigera jetströmmen, vilket hjälpte till att lösa kollapsen av bleb och därmed näthinneavlossning¹³. I den aktuella studien märkte vi inte någon sådan kollaps av bleb. Den möjliga orsaken till det kan vara ögonglobens större storlek och prestandan hos kärnvitrektomi med sparat glaskropp i periferin vid kanylinfusionsstället, vilket kan minska kraften hos den riktade jetströmmen.

Svårigheter under utstötningen av cellbäraren från instrumentet var ett annat intraoperativt hinder i smådjursmodellerna, som kategoriserades som "fångade med instrumentet". Dessutom föreslog författarna att resterande glaskropp på näthinnans yta kan orsaka ett bakåt "hopp" av bäraren ur retinotomiöppningen efter implantation. Detta problem kan lösas med en enzymassisterad vitrektomi, vilket möjliggör en jämn, kontinuerlig utstötning av cellbäraren i subretinalutrymmet. I de flesta fall flyttade författarna bäraren för att få en mer avlägsen plats för implantatet bort från retinotomi. I vår fallserie upplevde vi också en situation där cellbäraren förblev fäst vid injektorns spets. Det hanterades dock genom långsam och mild manipulation av ljusröret och injektorns spets. Vi observerade inte någon kvarvarande glaskropp på platsen för retinotomi i något av våra fall. Användningen av TA-assisterad PPV vid operationerna kan föreslås som en metod för att minska risken för kvarvarande glaskropp. Flera färgningar med TA kan vara nödvändiga för att helt avlägsna det överliggande glaskroppen.

I en annan studie rapporterades resultaten av subretinal implantation av humana RPE-stamceller odlade som ett polariserat cellulärt monolager på ett polyestermembran²⁴. Under experimenten användes samma kirurgiska teknik som beskrivits^{tidigare 13}, men en två-port PPV-metod tillämpades. Slutligen publicerades ett steg-för-steg-protokoll för subretinal implantation av cellbärarkirurgi hos kaniner senare²⁵. Denna studie presenterar en mycket detaljerad och lätt repeterbar beskrivning av det kirurgiska ingreppet, inklusive preoperativ och postoperativ vård, som också bygger på tidigare erfarenheter.

Vid användning av stordjursmodeller i efterföljande studier behandlades inte bara tekniska frågor utan även frågor om immunreaktionen mot de transplanterade cellerna, samt cellbärarstorleksrelaterade frågor. En studie med cynomolgusapor (Macaca fascicularis) beskrev resultaten av subretinal implantation av humana stamcellshärledda RPE-monolager¹⁵. Alla djuren genomgick systemisk immunsuppression, som bestod av sirolimus (laddningsdos på 2 mg, daglig dos på 1 mg) och tetracyklin (7,5 mg/kg^- kroppsvikt) med start 7 dagar före operationen och 3 månader efter operationen. Det kirurgiska ingreppet utfördes enligt protokoll som beskrivits tidigare^24,25. Författarna använde en 25 G tre-port PPV-strategi med ljuskrona endo-belysning. Viktigt är att en TA-assisterad PVD användes för att utesluta kvarvarande vitreoretinal vidhäftning på den bakre näthinnan. Som ett tillägg till den ursprungligen beskrivna proceduren tog författarna bort värd-RPE-skiktet i området för framtida implantation med hjälp av ett 20 G skräddarsytt utdragbart loopinstrument.

I vår minipig-studie använde vi också systemisk immunsuppression. Emellertid skilde sig typen av immunsuppression från den som beskrivits ovan. Vi administrerade en subkutan injektion av takrolimuseluerande polymermikrosfärer som en depå i en dos av 0,25 mg/kg kroppsvikt för att hämma celltransplantatavstötning och inflammatoriska reaktioner. Vi tog inte bort värd-RPE-cellskiktet under operationen, eftersom vårt primära mål var att analysera procedurens säkerhet och livskraften hos de implanterade cellerna men inte deras integration i värdnäthinnan.

Tidigare utvärderades säkerheten och genomförbarheten av subretinal implantation av ett monolager av hESC-härledda RPE på ett vikbart icke-nedbrytbart mesh-stött submikronparylen-C-membran (6,25 mm x 3,5 mm, 0,4 μm tjockt) hos 14 kvinnliga Yucatán-minigrisar¹⁰. Efter odling såddes cellerna på ett nätstött membran. Immunsuppression utfördes med systemisk administrering av takrolimus (ingen regim och dos indikerad) och intravitreala injektioner av 0,7 mg dexametasonimplantat vid slutet av operationen. PPV utfördes med en 20 G-strategi. Författarna använde en intravitreal injektion av triamcinolonacetonid för bättre visualisering av glaskroppen. Den stora sklerotomin var 2 mm till 3 mm stor. Efter subretinalinjektionen plattades näthinnan med en tillfällig injektion av perfluorkarbonvätska. Efter utbytet mellan vätska och luft utfördes en silikonoljetamponad (1 000/5 000 cSt). Postoperativ vård inkluderade okulär applicering av dexametason/neomycin/polymyxin B salva 1 vecka efter operationen. Författarna rapporterade en framgångsgrad på 91% (dvs. effektiv subretinal implantation och tillräcklig postoperativ bilddata). I vår studie användes intravitreal injektion av TA-kristaller intraoperativt och främst för att visualisera glaskroppen. Den lokala immunsuppressiva effekten av detta läkemedel är emellertid fortfarande oklar. De nanofibrösa cellbärarna som användes i vår studie var 5,2 mm x 2,1 mm och 3,7 μm tjocka, med porstorlekar på 0,4 μm. Under operationen utförde vi direkt FAX istället för att injicera perfluorkarbonvätska. Vår kirurgiska framgångsgrad (93,1%) överensstämde med och var något bättre än Koss et ^al.10.

Subretinal transplantation av helt nedbrytbara cellbärare (byggnadsställning) för subretinal implantation studerades först 2019 i Yorkshire grisar¹⁴. Studien var huvudsakligen inriktad på de biologiskt nedbrytbara egenskaperna hos fibrinhydrogelimplantat. Författarna noterade att den aggressiva immunsuppressionen som används på tamsvin kan hämma en lokal inflammatorisk reaktion som potentiellt orsakas under biologisk nedbrytning av fibrinhydrogelimplantaten. De specificerade dock inte den immunsuppressiva behandlingen som användes hos grisarna. Under PPV utförde de en 3,6 mm lång sklerotomi för införande av den subretinala implantationsanordningen parallellt med och cirka 3,5 mm bakom limbus. Dessutom använde de ett pneumatiskt drivet injektionssystem som syftade till att minska handplaceringsinstabiliteten orsakad av fingermanipulation. I vår fallserie var alla sklerotomier 2,5 mm till 3,0 mm från limbus. Den stora sklerotomin för införandet av injektorn var 3 mm lång. Implantationsinjektorn som användes i vår studie opererades för hand. Grundlig cautery av pars plana i ciliärkroppen och ett tillräckligt snitt inuti den stora sklerotomin verkar vara avgörande för att undvika intraoperativa komplikationer såsom iatrogen perifer retinalavskiljning, blödning och förlust av implantatet.

Sammanfattningsvis beskriver vi användningen av Liběchov minipig-modellen för transplantation av RPE-celler på biologiskt nedbrytbara bärare som ett behandlingsalternativ för ärftliga och förvärvade näthinnesjukdomar. Likheter i ögonanatomi och fysiologi, liksom med avseende på immunsystemet, tillåter oss att utveckla och förbättra kirurgiska tekniker och instrument för subretinal implantation av celler, som lätt kan överföras till behandling av mänskliga ögonsjukdomar. Det är viktigt att säkerställa att operationer på minigrisar utförs med samma instrument (inklusive implantationsleveransverktyg) när de används vid mänskliga operationer, vilket underlättar tillämpningen av vunnen erfarenhet och kunskap på människor. Alternativa storögda djurmodeller med närvaro av ett makulärt område, såsom icke-mänskliga primater, kan vara användbara för uppföljning och analys av de anatomiska och funktionella förändringarna efter subretinal implantation i det centrala retinala området. Den detaljerade beskrivningen av preoperativa, kirurgiska och postoperativa vårdprocedurer kommer att vara användbar för framtida studier genom att öka effektiv och standardiserad datagenerering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Technical equipment
Wato EX-65 with a Mindray iMEC10	Mindray, Shenzhen, China	Wato Ex-65	anesthesia machine
R-Evolution CR	Optikon, Rome, Italy	R-Evolution CR	phacoemulsifier/vitrectome
Green laser Merilas 532α	Meridian, Thun, Switzerland	Merilas 532α	ophthalmic green laser
Microscope Hi-R NEO 900A	Haag-Streit Surgical, Wedel, Germany)	Hi-R NEO 900A	ophthalmic surgery microscope
Camera Sony PMW-10MD	Sony, Tokyo, Japan	PMW-10MD	full HD medical 2-piece
Non-contact vitreoretinal surgical system MERLIN BIOM	Volk, Mentor, OH, USA	MERLIN BIOM	BIOM
Steam sterilizer	Tuttnauer Europe B.V., Breda, NL	3870 HSG	sterilizer
iCam100	Optovue, Fremont, CA, USA	iCAM100	funduscamera
iVue OCT100-2	Optovue, Fremont, CA, USA	iVue OCT100-2	OCT
Microsurgical instruments and devices
Cook Eye Speculum	Katena, New Jersey, US	K1-5403	15mm blades
Ophthalmology surgical drape	Hylyard, Alpharetta, Georgie, USA	79304	132 x 142cm
Disposable Two step vitrectomy system. (23 gauge/ 0.6 mm)	DORC, Zuidland, Netherlands	1272.ED06
Infusion line for 23G / 0.6 mm infusion cannula	DORC, Zuidland, Netherlands	1279.P
knife 2.75mm, IQ Geometry Tm Slit Knife Angled, Bevel Up	Surgical Specialties Corporation, Reading, USA	72-2761G
Extendible 41G subretinal injection needle. (23 gauge / 0.6 mm)	DORC, Zuidland, Netherlands	1270.EXT
Omnifix 3ml Luer Lock Solo siringe	BBraun, Melsungen, Germany	4617022V	3ml
1ml soft-inject Tuberculin	Henke Sass Wolf, Tuttlingen, Germany	5010.200V0	1ml
8-0 Coated Vicryl	Ethicon, Puerto Rico, USA	J409G
Purified Silicone Oil (in syringe) 10 ml	(FCI, Paris, France)	S5.7170	1000cSt
Pinnacle 360 Morris Vertical Scissors 23Ga	Synergetics, O'Fallon, USA	10.24.23PIN	23Ga
Revolution DSP 23Ga ILM forceps	Alcon, Geneva, Switzerland	706.44	Griesharber revolution
23ga Straight Laser Probe	Synergetics, O’Fallon, USA	55.21.23
FCI Protect 2.0%	FCI Ophthalmics, Paris, France	S5.9100	viscoelastic
DK Westcott style Stitch Scissors, Curve	Duckworth & Kent, Hertfordshire, England	1-501	Curve
Pierse Notched Forceps, 0,3mm Straigh	Duckworth & Kent, Hertfordshire, England	2-100-1E	0,3mm straigh
DK Harms-Tubingen Straight Tying Forceps	Duckworth & Kent, Hertfordshire, England	2-504E	6mm
DK Needle Holder, Straigh	Duckworth & Kent, Hertfordshire, England	3-201	9mm straigh
Medications and solutions
Unitropic 1% gtt.	UNIMED PHARMA spol. s r.o., Bratislava, Slovak republic	tropicamidum 10 mg/ml	eye drops
Diprophos	Merck Sharp & Dohme B.V., Haarlem, Netherlands	betamethasonum 7 mg/ml	1ml
Alcon BSS Irrigation Solution	Alcon, Geneva, Switzerland	balance salt solution (BSS)	500ml
Betaisodona	Mundipharma, Cambridge, United Kingdom	povidon-Iodine 1g/10ml	30ml
Depo-medrol 120mg	Pfizer, New Yourk, USA	methylprednisolon	5ml/200mg
Shotapen	Virbac Carros Cedex, France	benzylpenicillin, dihydrostreptomycin	250ml
Flunixin a.u.v.	Norbrook, Newry, Northern Ireland	flunixinum 50,0 mg	250ml
Tramal 100MG/2ML	Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschland	tramadol	2ml
Zoletil 100	Virbac Carros Cedex, France	tiletamine, zolazepam	100mg
Narkeran 10	Vetoquinol, Magny-Vernois, France	ketamin	2ml
Rometar 20mg/ml	Spofa pharmaceutica, Prague, Czech republic	xylazinum	20mg
Braunol 75mg/g	B.Braun medical, Prague, Czech republic	povidone iodine	75mg/g
Propofol 1% MCT/LCT	Fresenius Kabi, Bad Homburg, Deutschland	propofol	10mg/1ml
Isoflurane 100% Inhalation vapour, liquid	Piramal Critical Care Limited, West Drayton, United Kingdom	isoflurane	100%
Benoxi gtt.  4mg/1ml	Unimed pharma, Bratislava, Slovakia	oxybuprakaine	10ml
Neosynephrin POS 10% gtt.	Ursapharm , Saarbrücken, Deutschland	fenylefrin chloride	10ml
Ophthalmo-framykoin 1X5GM	Zentiva a.s.,  Prague, Czech republic	bacitracin zinc/hydrocortisone acetate/hydrocortisoneacetate/neomycin sulfate	5mg
Floxal ung.	Dr. Gerhard Mann Chem.-Pharm. Fabrik, Berlin, Germany	ofloxacin	0.30%
Eficur inj.	Hipra, Amer, Spain	ceftiofurum hydrochloridum	50mg / 1ml
Draxxin	Zoetis Inc., New Jersey, USA	tulathromycinum	100mg / 1ml
Tramal	Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschland	tramadoli hydrochloridum	100mg / 2ml
Xylapan	Vetoquinol, Magny-Vernois, France	xylazinum	0.4 mg/kg
Proparacaine hydrochlorid ophthalmic solution 0,5%	Bausch&Lomb Incorporated Tampa, FL, USA	Proparacaine hydrochlorid	0.50%
Prograf	Astellas Pharma, Deerfield, Illinois, USA	Tacrolimus powder	1mg
Cell carrier, cultivated cells cultures, and implantation injector
Falcon Cell Culture Inserts	Corning Inc., Kenneburg, ME, USA	353103
TrypLE Express Enzyme (1X)	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	12604021
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	11320033
Biolaminin 521 LN (LN521)	BioLamina, Sundbyberg, Sweden	LN521-02
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	35050061
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	J66742.0B
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich, San Luis, Mi, USA	P4333
CRALBP	Novus Biologicals, Abingdon, UK	NB100-74392
Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific, Germany	21202