الجمع الروتيني لمجموعات بيانات التبريد EM عالية الدقة باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل 200 كيلو فولت

تم إنشاء المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) كطريقة روتينية لتحديد بنية البروتين خلال العقد الماضي ، مع أخذ حصة متزايدة باستمرار من البيانات الهيكلية المنشورة. أدت التطورات الحديثة في تكنولوجيا TEM والأتمتة إلى تعزيز كل من سرعة جمع البيانات وجودة الصور التي تم الحصول عليها مع تقليل المستوى المطلوب من الخبرة للحصول على خرائط cryo-EM بدقة sub-3 Å. في حين تم الحصول على معظم هذه الهياكل عالية الدقة باستخدام أحدث أنظمة التبريد 300 كيلو فولت ، يمكن أيضا الحصول على هياكل عالية الدقة باستخدام أنظمة التبريد TEM 200 كيلو فولت ، خاصة عندما تكون مجهزة بمرشح طاقة. بالإضافة إلى ذلك، فإن أتمتة محاذاة المجهر وجمع البيانات مع تقييم جودة الصورة في الوقت الفعلي تقلل من تعقيد النظام وتضمن إعدادات المجهر المثلى، مما يؤدي إلى زيادة إنتاجية الصور عالية الجودة والإنتاجية الإجمالية لجمع البيانات. يوضح هذا البروتوكول تنفيذ التطورات التكنولوجية الحديثة وميزات الأتمتة على مجهر إلكتروني لنقل التبريد بجهد 200 كيلو فولت ويوضح كيفية جمع البيانات لإعادة بناء الخرائط ثلاثية الأبعاد التي تكفي لبناء نموذج ذري جديد . نحن نركز على أفضل الممارسات والمتغيرات الحرجة والقضايا الشائعة التي يجب مراعاتها لتمكين الجمع الروتيني لمجموعات بيانات cryo-EM عالية الدقة. يتم استعراض الموضوعات الأساسية التالية بالتفصيل على وجه الخصوص: i) أتمتة محاذاة المجهر ، ii) اختيار المناطق المناسبة للحصول على البيانات ، iii) المعلمات البصرية المثلى لجمع البيانات عالية الجودة وعالية الإنتاجية ، iv) ضبط مرشح الطاقة للتصوير بدون خسارة ، و v) إدارة البيانات وتقييم الجودة. سيتم عرض تطبيق أفضل الممارسات وتحسين الدقة القابلة للتحقيق باستخدام مرشح الطاقة على مثال apo-ferritin الذي أعيد بناؤه إلى 1.6 Å ، و Thermoplasma acidophilum 20S proteasome المعاد بناؤه إلى دقة 2.1-Å باستخدام TEM 200 kV المجهز بمرشح طاقة وكاشف إلكترون مباشر.