Rutinemæssig indsamling af kryo-EM-datasæt i høj opløsning ved hjælp af 200 KV transmissionselektronmikroskop

Kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) er blevet etableret som en rutinemæssig metode til bestemmelse af proteinstruktur i løbet af det sidste årti og har taget en stadigt stigende andel af offentliggjorte strukturelle data. De seneste fremskridt inden for TEM-teknologi og automatisering har øget både hastigheden af dataindsamlingen og kvaliteten af erhvervede billeder og samtidig reduceret det krævede ekspertiseniveau for at opnå cryo-EM-kort i opløsninger under 3 Å. Mens de fleste af sådanne højopløsningsstrukturer er opnået ved hjælp af state-of-the-art 300 kV cryo-TEM-systemer, kan højopløsningsstrukturer også opnås med 200 kV cryo-TEM-systemer, især når de er udstyret med et energifilter. Derudover reducerer automatisering af mikroskopjusteringer og dataindsamling med billedkvalitetsvurdering i realtid systemkompleksiteten og sikrer optimale mikroskopindstillinger, hvilket resulterer i øget udbytte af billeder i høj kvalitet og samlet gennemstrømning af dataindsamling. Denne protokol demonstrerer implementeringen af de seneste teknologiske fremskridt og automatiseringsfunktioner på et 200 kV kryotransmissionselektronmikroskop og viser, hvordan man indsamler data til rekonstruktion af 3D-kort, der er tilstrækkelige til de novo atommodelbygning. Vi fokuserer på bedste praksis, kritiske variabler og almindelige problemer, der skal overvejes for at muliggøre rutinemæssig indsamling af sådanne kryo-EM-datasæt i høj opløsning. Især følgende væsentlige emner gennemgås i detaljer: i) automatisering af mikroskopjusteringer, ii) udvælgelse af egnede områder til dataindsamling, iii) optimale optiske parametre til dataindsamling af høj kvalitet, høj gennemstrømning, iv) energifilterindstilling til nul-tabsbilleddannelse og v) datastyring og kvalitetsvurdering. Anvendelse af bedste praksis og forbedring af opnåelig opløsning ved hjælp af et energifilter vil blive demonstreret på eksemplet med apo-ferritin, der blev rekonstrueret til 1,6 Å, og Thermoplasma acidophilum 20S proteasom rekonstrueret til 2,1-Å opløsning ved hjælp af en 200 kV TEM udstyret med et energifilter og en direkte elektrondetektor.