Routinematige verzameling van cryo-EM-datasets met hoge resolutie met behulp van 200 KV transmissie-elektronenmicroscoop

Cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) is het afgelopen decennium vastgesteld als een routinemethode voor het bepalen van de eiwitstructuur, waarbij een steeds groter deel van de gepubliceerde structurele gegevens is ingenomen. Recente ontwikkelingen in TEM-technologie en automatisering hebben zowel de snelheid van gegevensverzameling als de kwaliteit van verkregen beelden verhoogd, terwijl tegelijkertijd het vereiste niveau van expertise voor het verkrijgen van cryo-EM-kaarten met sub-3 Å-resoluties is verminderd. Hoewel de meeste van dergelijke structuren met hoge resolutie zijn verkregen met behulp van state-of-the-art 300 kV cryo-TEM-systemen, kunnen structuren met hoge resolutie ook worden verkregen met 200 kV cryo-TEM-systemen, vooral wanneer ze zijn uitgerust met een energiefilter. Bovendien vermindert automatisering van microscoopuitlijningen en gegevensverzameling met real-time beeldkwaliteitsbeoordeling de complexiteit van het systeem en zorgt het voor optimale microscoopinstellingen, wat resulteert in een hogere opbrengst van beelden van hoge kwaliteit en de algehele doorvoer van gegevensverzameling. Dit protocol demonstreert de implementatie van recente technologische vooruitgang en automatiseringsfuncties op een 200 kV cryotransmissie-elektronenmicroscoop en laat zien hoe gegevens kunnen worden verzameld voor de reconstructie van 3D-kaarten die voldoende zijn voor de novo atomaire modelbouw. We richten ons op best practices, kritieke variabelen en veelvoorkomende problemen waarmee rekening moet worden gehouden om de routinematige verzameling van dergelijke cryo-EM-datasets met hoge resolutie mogelijk te maken. In het bijzonder worden de volgende essentiële onderwerpen in detail besproken: i) automatisering van microscoopuitlijningen, ii) selectie van geschikte gebieden voor gegevensverzameling, iii) optimale optische parameters voor hoogwaardige gegevensverzameling met hoge doorvoer, iv) energiefilterafstemming voor verliesvrije beeldvorming, en v) gegevensbeheer en kwaliteitsbeoordeling. Toepassing van de beste praktijken en verbetering van de haalbare resolutie met behulp van een energiefilter zal worden gedemonstreerd op het voorbeeld van apo-ferritine dat werd gereconstrueerd tot 1,6 Å, en Thermoplasma acidophilum 20S proteasoom gereconstrueerd tot 2,1-Å resolutie met behulp van een 200 kV TEM uitgerust met een energiefilter en een directe elektronendetector.