Collecte de routine d’ensembles de données cryo-EM haute résolution à l’aide d’un microscope électronique à transmission de 200 KV

La cryo-microscopie électronique (cryo-EM) a été établie comme une méthode de routine pour la détermination de la structure des protéines au cours de la dernière décennie, prenant une part toujours croissante des données structurelles publiées. Les progrès récents de la technologie TEM et de l’automatisation ont augmenté à la fois la vitesse de collecte des données et la qualité des images acquises tout en diminuant simultanément le niveau d’expertise requis pour obtenir des cartes cryo-EM à des résolutions inférieures à 3 Å. Alors que la plupart de ces structures à haute résolution ont été obtenues à l’aide de systèmes cryo-TEM de 300 kV à la pointe de la technologie, des structures à haute résolution peuvent également être obtenues avec des systèmes cryo-TEM de 200 kV, en particulier lorsqu’elles sont équipées d’un filtre à énergie. De plus, l’automatisation des alignements de microscopes et de la collecte de données avec une évaluation de la qualité d’image en temps réel réduit la complexité du système et assure des réglages optimaux du microscope, ce qui se traduit par un rendement accru d’images de haute qualité et un débit global de collecte de données. Ce protocole démontre la mise en œuvre des avancées technologiques récentes et des fonctionnalités d’automatisation sur un microscope électronique à cryo-transmission de 200 kV et montre comment collecter des données pour la reconstruction de cartes 3D suffisantes pour la construction de modèles atomiques de novo . Nous nous concentrons sur les meilleures pratiques, les variables critiques et les problèmes courants qui doivent être pris en compte pour permettre la collecte de routine de tels ensembles de données cryo-EM à haute résolution. En particulier, les sujets essentiels suivants sont examinés en détail: i) automatisation des alignements de microscopes, ii) sélection de zones appropriées pour l’acquisition de données, iii) paramètres optiques optimaux pour la collecte de données de haute qualité et à haut débit, iv) réglage du filtre d’énergie pour l’imagerie sans perte, et v) gestion des données et évaluation de la qualité. L’application des meilleures pratiques et l’amélioration de la résolution réalisable à l’aide d’un filtre à énergie seront démontrées sur l’exemple de l’apo-ferritine qui a été reconstruite à 1,6 Å, et du protéasome Thermoplasma acidophilum 20S reconstruit à une résolution de 2,1-Å à l’aide d’un TEM de 200 kV équipé d’un filtre d’énergie et d’un détecteur d’électrons direct.