Routinemäßige Sammlung von hochauflösenden Kryo-EM-Datensätzen mit einem 200-KV-Transmissionselektronenmikroskop

Die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) hat sich in den letzten zehn Jahren als Routinemethode zur Bestimmung der Proteinstruktur etabliert und nimmt einen immer größeren Anteil der veröffentlichten Strukturdaten ein. Jüngste Fortschritte in der TEM-Technologie und -Automatisierung haben sowohl die Geschwindigkeit der Datenerfassung als auch die Qualität der aufgenommenen Bilder erhöht und gleichzeitig das erforderliche Maß an Fachwissen für die Beschaffung von Kryo-EM-Karten mit Auflösungen unter 3 Å verringert. Während die meisten dieser hochauflösenden Strukturen mit modernsten 300-kV-Kryo-TEM-Systemen erhalten wurden, können hochauflösende Strukturen auch mit 200-kV-Kryo-TEM-Systemen erhalten werden, insbesondere wenn sie mit einem Energiefilter ausgestattet sind. Darüber hinaus reduziert die Automatisierung der Mikroskopausrichtung und Datenerfassung mit Echtzeit-Bildqualitätsbewertung die Systemkomplexität und gewährleistet optimale Mikroskopeinstellungen, was zu einer erhöhten Ausbeute an qualitativ hochwertigen Bildern und einem Gesamtdurchsatz der Datenerfassung führt. Dieses Protokoll demonstriert die Implementierung der jüngsten technologischen Fortschritte und Automatisierungsfunktionen auf einem 200-kV-Kryo-Transmissionselektronenmikroskop und zeigt, wie Daten für die Rekonstruktion von 3D-Karten gesammelt werden können, die für die Erstellung von De-novo-Atommodellen ausreichen. Wir konzentrieren uns auf Best Practices, kritische Variablen und häufige Probleme, die berücksichtigt werden müssen, um die routinemäßige Erfassung solcher hochauflösenden Kryo-EM-Datensätze zu ermöglichen. Insbesondere werden folgende wesentliche Themen im Detail behandelt: i) Automatisierung der Mikroskopausrichtung, ii) Auswahl geeigneter Bereiche für die Datenerfassung, iii) optimale optische Parameter für eine qualitativ hochwertige Datenerfassung mit hohem Durchsatz, iv) Energiefilter-Tuning für verlustfreie Bildgebung und v) Datenmanagement und Qualitätsbewertung. Die Anwendung der Best Practices und die Verbesserung der erreichbaren Auflösung unter Verwendung eines Energiefilters werden am Beispiel von Apoferritin demonstriert, das auf 1,6 Å rekonstruiert wurde, und Thermoplasma acidophilum 20S Proteasom, das mit einem 200-kV-TEM, das mit einem Energiefilter und einem direkten Elektronendetektor ausgestattet ist, auf eine Auflösung von 2,1 Å rekonstruiert wurde.