איסוף שגרתי של מערכי נתונים cryo-EM ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים של 200 KV

מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים (cryo-EM) הוקמה כשיטה שגרתית לקביעת מבנה חלבונים במהלך העשור האחרון, תוך לקיחת נתח הולך וגדל של נתונים מבניים שפורסמו. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיית TEM ובאוטומציה הגבירה הן את מהירות איסוף הנתונים והן את איכות התמונות שנרכשו, ובמקביל הפחיתה את רמת המומחיות הנדרשת להשגת מפות cryo-EM ברזולוציות תת-3 Å. בעוד שרוב המבנים ברזולוציה גבוהה כאלה הושגו באמצעות מערכות cryo-TEM חדישות של 300 kV, ניתן להשיג מבנים ברזולוציה גבוהה גם עם מערכות cryo-TEM של 200 קילו-וולט, במיוחד כאשר הם מצוידים במסנן אנרגיה. בנוסף, אוטומציה של יישור מיקרוסקופים ואיסוף נתונים עם הערכת איכות תמונה בזמן אמת מפחיתה את מורכבות המערכת ומבטיחה הגדרות מיקרוסקופ אופטימליות, וכתוצאה מכך תפוקה מוגברת של תמונות באיכות גבוהה ותפוקה כוללת של איסוף נתונים. פרוטוקול זה מדגים את היישום של ההתקדמות הטכנולוגית האחרונה ותכונות האוטומציה על מיקרוסקופ אלקטרונים של 200 kV קריו-שידור ומראה כיצד לאסוף נתונים לשחזור מפות תלת-ממדיות המספיקות לבניית מודל אטומי דה נובו . אנו מתמקדים בשיטות עבודה מומלצות, משתנים קריטיים ובעיות נפוצות שיש לקחת בחשבון כדי לאפשר איסוף שגרתי של מערכי נתונים קריו-EM ברזולוציה גבוהה כאלה. במיוחד הנושאים החיוניים הבאים נסקרים בפירוט: א) אוטומציה של יישור מיקרוסקופים, ב) בחירת אזורים מתאימים לרכישת נתונים, iii) פרמטרים אופטיים אופטימליים לאיסוף נתונים באיכות גבוהה ובתפוקה גבוהה, iv) כוונון מסנן אנרגיה להדמיה ללא הפסד, ו- v) ניהול נתונים והערכת איכות. יישום שיטות העבודה המומלצות ושיפור הרזולוציה הניתנת להשגה באמצעות מסנן אנרגיה יודגמו בדוגמה של אפו-פריטין ששוחזר ל-1.6 Å, ותרמופלסמה אצידופילום 20S פרוטאזום ששוחזר לרזולוציה של 2.1-Å באמצעות TEM של 200 קילו-וולט המצויד במסנן אנרגיה ובגלאי אלקטרונים ישיר.