200 केवी ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईएम डेटासेट का नियमित संग्रह

क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) को पिछले दशक के दौरान प्रोटीन संरचना निर्धारण के लिए एक नियमित विधि के रूप में स्थापित किया गया है, जो प्रकाशित संरचनात्मक डेटा का लगातार बढ़ता हिस्सा ले रहा है। TEM प्रौद्योगिकी और स्वचालन में हाल ही में प्रगति ने डेटा संग्रह की गति और अधिग्रहित छवियों की गुणवत्ता दोनों को बढ़ावा दिया है, जबकि साथ ही साथ उप-3 Å संकल्पों पर क्रायो-ईएम मानचित्र प्राप्त करने के लिए विशेषज्ञता के आवश्यक स्तर को कम कर दिया है। जबकि इस तरह की अधिकांश उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं को अत्याधुनिक 300 केवी क्रायो-टीईएम सिस्टम का उपयोग करके प्राप्त किया गया है, उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं को 200 केवी क्रायो-टीईएम सिस्टम के साथ भी प्राप्त किया जा सकता है, खासकर जब ऊर्जा फिल्टर से सुसज्जित हो। इसके अतिरिक्त, वास्तविक समय की छवि गुणवत्ता मूल्यांकन के साथ माइक्रोस्कोप संरेखण और डेटा संग्रह का स्वचालन सिस्टम जटिलता को कम करता है और इष्टतम माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का आश्वासन देता है, जिसके परिणामस्वरूप उच्च गुणवत्ता वाली छवियों की उपज में वृद्धि होती है और डेटा संग्रह का समग्र थ्रूपुट होता है। यह प्रोटोकॉल 200 केवी क्रायो-ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप पर हाल ही में तकनीकी प्रगति और स्वचालन सुविधाओं के कार्यान्वयन को दर्शाता है और दिखाता है कि 3 डी मानचित्रों के पुनर्निर्माण के लिए डेटा कैसे एकत्र किया जाए जो डे नोवो परमाणु मॉडल निर्माण के लिए पर्याप्त हैं। हम सर्वोत्तम प्रथाओं, महत्वपूर्ण चर और सामान्य मुद्दों पर ध्यान केंद्रित करते हैं जिन्हें इस तरह के उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईएम डेटासेट के नियमित संग्रह को सक्षम करने के लिए माना जाना चाहिए। विशेष रूप से निम्नलिखित आवश्यक विषयों की विस्तार से समीक्षा की जाती है: i) माइक्रोस्कोप संरेखण का स्वचालन, ii) डेटा अधिग्रहण के लिए उपयुक्त क्षेत्रों का चयन, iii) उच्च गुणवत्ता, उच्च-थ्रूपुट डेटा संग्रह के लिए इष्टतम ऑप्टिकल पैरामीटर, iv) शून्य-हानि इमेजिंग के लिए ऊर्जा फ़िल्टर ट्यूनिंग, और v) डेटा प्रबंधन और गुणवत्ता मूल्यांकन। सर्वोत्तम प्रथाओं के आवेदन और एक ऊर्जा फिल्टर का उपयोग करके प्राप्त करने योग्य संकल्प के सुधार को एपो-फेरिटिन के उदाहरण पर प्रदर्शित किया जाएगा जिसे 1.6 Å तक पुनर्निर्मित किया गया था, और थर्मोप्लाज्मा एसिडोफिलम 20S को एक ऊर्जा फिल्टर और एक प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर से सुसज्जित 200 केवी टीईएम का उपयोग करके 2.1-Å रिज़ॉल्यूशन में पुनर्निर्मित किया गया था।