Raccolta di routine di set di dati crio-EM ad alta risoluzione utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione da 200 KV

La microscopia crioelettronica (cryo-EM) è stata stabilita come metodo di routine per la determinazione della struttura proteica negli ultimi dieci anni, prendendo una quota sempre crescente di dati strutturali pubblicati. I recenti progressi nella tecnologia e nell'automazione TEM hanno aumentato sia la velocità di raccolta dei dati che la qualità delle immagini acquisite, riducendo contemporaneamente il livello di competenza richiesto per ottenere mappe crio-EM a risoluzioni inferiori a 3 Å. Mentre la maggior parte di tali strutture ad alta risoluzione sono state ottenute utilizzando sistemi crio-TEM a 300 kV all'avanguardia, le strutture ad alta risoluzione possono essere ottenute anche con sistemi crio-TEM da 200 kV, specialmente se dotati di un filtro di energia. Inoltre, l'automazione degli allineamenti dei microscopi e della raccolta dei dati con valutazione della qualità delle immagini in tempo reale riduce la complessità del sistema e assicura impostazioni ottimali del microscopio, con conseguente aumento della resa di immagini di alta qualità e throughput complessivo della raccolta dei dati. Questo protocollo dimostra l'implementazione dei recenti progressi tecnologici e delle funzionalità di automazione su un microscopio elettronico a criotrasmissione da 200 kV e mostra come raccogliere dati per la ricostruzione di mappe 3D sufficienti per la costruzione di modelli atomici de novo . Ci concentriamo sulle best practice, sulle variabili critiche e sui problemi comuni che devono essere considerati per consentire la raccolta di routine di tali set di dati crio-EM ad alta risoluzione. In particolare, vengono esaminati in dettaglio i seguenti argomenti essenziali: i) automazione degli allineamenti del microscopio, ii) selezione delle aree adatte per l'acquisizione dei dati, iii) parametri ottici ottimali per la raccolta di dati di alta qualità e ad alta produttività, iv) sintonizzazione del filtro energetico per l'imaging a perdita zero e v) gestione dei dati e valutazione della qualità. L'applicazione delle migliori pratiche e il miglioramento della risoluzione raggiungibile utilizzando un filtro energetico saranno dimostrati sull'esempio di apo-ferritina che è stata ricostruita a 1,6 Å e del proteasoma Thermoplasma acidophilum 20S ricostruito a risoluzione 2,1-Å utilizzando un TEM da 200 kV dotato di un filtro energetico e di un rivelatore di elettroni diretto.