Rutinemessig innsamling av kryo-EM-datasett med høy oppløsning ved bruk av 200 KV-transmisjonselektronmikroskop

Kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM) har blitt etablert som en rutinemessig metode for proteinstrukturbestemmelse det siste tiåret, og tar en stadig økende andel av publiserte strukturelle data. Nylige fremskritt innen TEM-teknologi og automatisering har økt både hastigheten på datainnsamling og kvalitet på innsamvede bilder, samtidig som det reduserer det nødvendige kompetansenivået for å skaffe kryo-EM-kart ved sub-3 Å-oppløsninger. Mens de fleste av slike høyoppløselige strukturer er oppnådd ved hjelp av toppmoderne 300 kV cryo-TEM-systemer, kan høyoppløselige strukturer også oppnås med 200 kV cryo-TEM-systemer, spesielt når de er utstyrt med et energifilter. I tillegg reduserer automatisering av mikroskopjusteringer og datainnsamling med bildekvalitetsvurdering i sanntid systemkompleksiteten og sikrer optimale mikroskopinnstillinger, noe som resulterer i økt utbytte av bilder av høy kvalitet og generell gjennomstrømning av datainnsamling. Denne protokollen demonstrerer implementeringen av nyere teknologiske fremskritt og automatiseringsfunksjoner på et 200 kV kryooverføringselektronmikroskop og viser hvordan man samler inn data for rekonstruksjon av 3D-kart som er tilstrekkelig for de novo atommodellbygging. Vi fokuserer på beste praksis, kritiske variabler og vanlige problemer som må vurderes for å muliggjøre rutinemessig innsamling av slike høyoppløselige cryo-EM-datasett. Spesielt følgende viktige emner gjennomgås i detalj: i) automatisering av mikroskopjusteringer, ii) valg av egnede områder for datainnsamling, iii) optimale optiske parametere for innsamling av data av høy kvalitet, iv) energifilterjustering for nulltapsavbildning og v) datahåndtering og kvalitetsvurdering. Anvendelse av beste praksis og forbedring av oppnåelig oppløsning ved hjelp av et energifilter vil bli demonstrert på eksempelet på apo-ferritin som ble rekonstruert til 1,6 Å, og Thermoplasma acidophilum 20S proteasome rekonstruert til 2,1-Å oppløsning ved hjelp av en 200 kV TEM utstyrt med et energifilter og en direkte elektrondetektor.