Coleta rotineira de conjuntos de dados crio-EM de alta resolução usando microscópio eletrônico de transmissão de 200 KV

A microscopia crio-elétron (crio-EM) foi estabelecida como um método rotineiro para a determinação da estrutura proteica durante a última década, tomando uma parcela cada vez maior dos dados estruturais publicados. Os recentes avanços na tecnologia e automação TEM aumentaram tanto a velocidade de coleta de dados quanto a qualidade das imagens adquiridas, ao mesmo tempo em que diminuíram o nível de experiência necessário para a obtenção de mapas crio-EM em resoluções sub-3 Å. Embora a maioria dessas estruturas de alta resolução tenha sido obtida usando sistemas crio-TEM de última geração de 300 kV, estruturas de alta resolução também podem ser obtidas com sistemas crio-TEM de 200 kV, especialmente quando equipadas com um filtro de energia. Além disso, a automação de alinhamentos de microscópios e coleta de dados com avaliação da qualidade da imagem em tempo real reduz a complexidade do sistema e garante configurações ideais de microscópio, resultando em aumento do rendimento de imagens de alta qualidade e rendimento geral da coleta de dados. Este protocolo demonstra a implementação de recentes avanços tecnológicos e recursos de automação em um microscópio eletrônico criotransiência de 200 kV e mostra como coletar dados para a reconstrução de mapas 3D suficientes para a construção do modelo atômico de Novo . Focamos nas melhores práticas, variáveis críticas e questões comuns que devem ser consideradas para permitir a coleta rotineira de tais conjuntos de dados crio-EM de alta resolução. Particularmente os seguintes tópicos essenciais são revisados em detalhes: i) automação de alinhamentos de microscópio, ii) seleção de áreas adequadas para aquisição de dados, iii) parâmetros ópticos ideais para coleta de dados de alta qualidade, coleta de dados de alto rendimento, iv) ajuste de filtro de energia para imagem de perda zero e v) gerenciamento de dados e avaliação da qualidade. A aplicação das melhores práticas e melhoria da resolução alcançável usando um filtro de energia será demonstrada no exemplo da apo-ferritin que foi reconstruída a 1,6 Å, e thermoplasma acidophilum 20S proteasome reconstruída à resolução 2.1-Å usando um TEM de 200 kV equipado com um filtro de energia e um detector de elétrons direto.